色素上皮衍生因子在结直肠癌中的作用

杨 邺,文 武,张颖杰,蒋 烨,胡珊珊 ,陈凤林

(1.成都市青白江区人民医院消化内科,四川 成都 610300;2.成都市第二人民医院消化内科,四川 成都 610017)

在全球范围内结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是第三大最常见的癌症,其死亡率排名第二[1],随着社会经济发展水平的提高其发病率还将继续增加。目前国内外公认的治疗手段主要包括了内镜和手术切除,术前降期放化疗,复发或转移性结直肠癌的多学科综合治疗,靶向治疗和免疫治疗等[2]。局限性结直肠癌患者的5年相对存活率约90%,但是一旦发生远处转移则下降至14%左右[3],20%患者在初诊时就已发生远处转移从而失去了根治性手术的机会,非手术治疗对提高患者的生存率有着举足轻重的作用。色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor,PEDF)是一种有效的血管生成抑制剂[4],抑制肿瘤相关血管生成是控制癌症进展的一种有前景的治疗方式,PEDF作为抗血管生成治疗的标志物对评估肿瘤的进展和预后具有潜在的临床价值,目前PEDF在胰腺癌、黑色素瘤等多种实体肿瘤中的抗肿瘤作用已得到证实[5,6]。本文总结了PEDF在CRC中的表达情况,分析了PEDF在结直肠癌中可能的抗肿瘤机制及治疗作用,同时探讨了PEDF在CRC中的研究前景。

1 PEDF概述

色素上皮衍生因子是由418个氨基酸组成的相对分子质量约为50 KDa的分泌性糖蛋白,于1989年首次在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的条件培养基中作为一种神经元分化诱导因子被发现,是Y79视网膜母细胞瘤细胞神经元分化的诱导剂[7],它与丝氨酸蛋白酶抑制剂 (Serpin) 超家族成员具有结构和序列同源性[8]。PEDF蛋白带有一个蛋白酶敏感暴露环的球状构象,包含C末端的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族反应环和N末端的促进神经活性的区域,它虽然在典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂溶液中具有折叠的蛋白质结构,但PEDF属于非抑制性丝氨酸蛋白酶抑制剂[9]。

1999年Dawson等[10]首次发现PEDF具有抗血管新生活性的作用。人血浆中纯化的PEDF可以被蛋白激酶2(CK2)及蛋白激酶A(PKA)磷酸化,PEDF的功能受细胞外磷酸化位点调节,CK2 磷酸化的PEDF神经营养活性降低,而其抗血管生成活性显著增加[11]。PEDF基因由SERPINF1基因编码,最早出现在脊椎动物中,该基因的调节和生物学作用在脊椎动物中得以保留,人类PEDF基因位于第17号染色体短臂1区3带1亚带(17p13.1),这是一个包含一组癌症相关基因的区域,基因全长约15.6 kb,分为了8个外显子和7个内含子[12,13],它在哺乳动物物种的进化中显示出了强烈的保守性,PEDF基因在眼、乳腺、宫颈、胰腺、肝脏、食管、结肠等组织中广泛表达。

2 PEDF在各种肿瘤中的作用

PEDF在眼部黑色素瘤动物模型中抑制了抗血管生成反应从而减少了肝转移[6],乳腺癌组织中PEDF表达下降,它与层粘连蛋白相互作用抑制了NADPH氧化酶诱导的ROS生成以及VEGF和MMP-9的表达,进而对乳腺癌的生长和转移起抑制作用[14]。PEDF在宫颈癌组织中表达水平也下降,它通过双重抑制PI3K/Akt信号通路降低宫颈癌HeLa细胞活性和侵袭相关蛋白的表达[15]。在胰腺癌组织中PEDF的表达与TNM分期、淋巴结有无转移有关,它减弱了纤维炎症反应从而限制胰腺癌的进展[5]。虽然PEDF在大部分肿瘤中表达下调并抑制肿瘤的生长及转移,但它在部分肿瘤中也存在相反的作用。与邻近的正常组织相比,肝细胞癌中PEDF表达增加,过表达的PEDF显著增强了肝细胞癌体内外癌细胞的迁移和转移[16],对于PEDF的这种相反作用,Li等[17]建立了异位肿瘤移植小鼠模型,通过 PEDF 对肿瘤血管生成和FFA代谢的双重调节揭示了PEDF在HCC发展中相反的细胞内和细胞外功能,并表明PEDF过表达可以在早期显著诱导肝细胞癌的生长,而在晚期则轻微降低肿瘤生长。同样,PEDF在食管癌患者肿瘤组织和食管癌细胞中也过度表达,PEDF在食管鳞状细胞癌中也可诱导肿瘤发生[18]。

3 PEDF在CRC中的表达情况

3.1 CRC组织中PEDF水平在患者CRC组织PEDF表达差异性相关研究中,检测方法多种多样,通过采用反转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(westernblot)、免疫组化染色法(immunohistochemical staining,IHC)实验表明,CRC组织中PEDF表达水平比癌旁组织低,且其表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移及临床分期呈负相关[19,20],肿瘤组织中PEDF表达的降低与生存时间的缩短显著相关[19];利用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法研究发现CRC组织中PEDF mRNA的表达也明显低于相应癌旁组织,其表达与年龄、性别、肿瘤大小差异无统计学意义,早期患者CRC组织中PEDFmRNA的表达比晚期患者明显升高,肿瘤组织中PEDF mRNA的表达量与组织分化程度呈正相关[21];此外,Harries等[22]在采用定量聚合酶链反应(qPCR)和IHC方法对其研究也表明PEDF在CRC细胞组织中表达下调,且随着肿瘤分级的恶化而显著下降,同时其研究结果还表明在转录分析中PEDF在女性CRC中的表达比男性高(这一结果与Wågsäter等[23]的观点相反),在直肠癌中的表达比结肠癌中高,在IHC中,PEDF在高分化的粘液腺癌中的表达更明显,而在肿瘤位置的表达上并没有明显差异。上述研究虽然利用了不同的检测方法,但结果都显示PEDF在CRC组织中表达下降,这与早期Wågsäter等[23]通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测定量研究所示的在CRC组织中的PEDF表达与配对正常组织相比并没有显著差异相矛盾,导致结论差异的原因需要借助后续研究进一步明确。

3.2 CRC细胞中PEDF水平在采用体外功能试验法检测重组PEDF处理对细胞功能的影响的研究中发现,PEDF在CRC细胞系和CRC细胞中的表达低于正常结直肠成纤维细胞[22];Ji等[19]的研究表明PEDF在正常黏膜、结直肠原发癌和结直肠腺瘤细胞的细胞质和细胞膜中均有表达,然而,PEDF在癌细胞中的表达比正常黏膜明显下降。

3.3 CRC血液中PEDF水平2010年Wågsäter等[23]对CRC患者组织和血浆中PEDF蛋白表达做了首次定量分析研究,研究显示CRC患者组的血浆PEDF水平明显低于健康对照组,健康对照组的男性血浆PEDF水平明显高于女性,然而CRC患者的血浆PEDF水平与性别或其他临床特征无关。其中CRC血清中PEDF的表达低于健康对照组这一结果在Ji等[19]的研究中也得到了证实,此外还发现结直肠腺瘤患者与健康对照组血清PEDF之间无显著差异,低血清PEDF水平与TNM分期和肝转移以及较差的总生存率相关,血清PEDF水平随CRCTNM分期恶化而显著降低,黏液性腺癌患者血清PEDF水平明显高于腺癌患者。

总之,大量研究显示PEDF在CRC组织、细胞、血液中的表达降低,并与肿瘤的恶性程度及转移有显著关系,这种表达的差异性可能对CRC患者的治疗和预后的评估有指导意义。

4 PEDF在CRC中可能的抗肿瘤机制

4.1 降低微血管密度、抑制肿瘤血管的生成在实体瘤的发展过程中,新生血管生长是必要的。PEDF可诱导内皮细胞表达Fas配体(FasL),内皮细胞的凋亡可以通过FasL与Fas受体结合来诱导,而高浓度的抗凋亡蛋白存在于正常血管内皮细胞使得其不表达Fas受体,PEDF可选择性抑制新生血管内皮细胞的增殖并保留预先存在的血管系统[24]。装载在PLGA纳米粒中的PEDF基因(PEDF- PGLANPs)通过降低微血管密度和抑制血管生成在体内抑制小鼠结肠癌细胞(CT26)的生长[25]。C26荷瘤小鼠模型中,装载PEDF基因的CPPC纳米颗粒(D-NPs)与负载空质粒的PEG-PLGA纳米颗粒(Dv-NPs)相比,6小时内二者均在基质凝胶表面形成毛细血管样结构,但D-NPs显著破坏了管的形成,同时D-NPs处理的小鼠的海藻酸盐珠中的新生血管明显稀疏,D-NPs通过抑制内皮细胞的增殖和小管状形成、阻断体内外血管生成来抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的存活时间[26]。Bao等[27]基于CD31作为血管生成的生物标志物这一基础,在注射CT26细胞的小鼠模型及肺转移模型中研究了iRGD肽制备的肿瘤靶向PEDF-DNA脂质体(R-LP/PEDF)对血管生成的影响,经LP/PEDF和R-LP/PEDF治疗后,肿瘤组织中CD31阳性细胞较少,LP/PEDF和R-LP/PEDF治疗抑制了肿瘤组织的血管生成并起到了抗肿瘤的作用。此外,在荷瘤小鼠模型中PEDF+5-FU组肿瘤组织中微血管数量较对照组和5FU组明显减少,PEDF和5-FU联合用药可对CT26结肠癌细胞起到协同治疗作用,且效果优于单独用5-FU[28]。总之,各项研究发现PEDF可通过降低微血管密度、抑制肿瘤血管新生起到抗CRC的作用。

4.2 抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡在体内外,PEDF-PLGANPs可诱导CT26凋亡来抑制CT26肿瘤的生长[25];在接受新辅助放疗的局部晚期直肠癌研究中,PEDF可以抑制直肠癌细胞的增殖并抑制裸鼠异种肿瘤生长[29];腺病毒转染PEDF可以增强肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的生长[30]。在静脉注射C26皮下肿瘤模型中装载PEDF基因的CPPC纳米颗粒(D-NPs)具有显著的抗肿瘤活性并促进肿瘤细胞凋亡[26];通过诱导细胞凋亡,肿瘤靶向的PEDF-DNA脂质体(R-LP/PEDF)对转移性CRC模型起到有效的抗肿瘤作用[27]。PEDF+5-FU组荷瘤小鼠肿瘤体积小于5-FU组,PEDF+5-FU组细胞凋亡率高于5-FU组,且抗肿瘤的效果优于5-FU组[28]。上述大量研究均表明PEDF在CRC中的抗肿瘤作用与其可以抑制肿瘤细胞的增值、诱导细胞凋亡密切相关。

4.3 防止肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移癌细胞的迁移和侵袭在转移中有重要作用,大约90%的癌症患者死于肿瘤转移而不是原发肿瘤的生长,转移性CRC患者预后较差。高水平的PEDF表达通过抑制局部晚期直肠癌患者的肿瘤生长和转移来促进无病生存期时间[29];通过腺病毒转导分泌PEDF的间充质干细胞显著抑制了CT26结直肠腹膜癌扩散小鼠的肿瘤转移和恶性腹水形成[30];重组PEDF治疗显著降低了CRC细胞系的CRC细胞迁移和侵袭率,使细胞粘附增加,预防CRC转移扩散[22];并且PEDF衍生肽可降低结肠癌细胞系异种移植肿瘤的复发和转移[31]。在CRC中,防止肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移是PEDF抗肿瘤的机制之一。

4.4 受体介导的信号通路血浆中PEDF可以被CK2及PKA磷酸化,其功能受细胞外磷酸化位点调节[11],在HCT116(结肠癌)异种移植模型中,三重拟磷突变体 (EEE-PEDF)可以提供比野生型PEDF(WT-PEDF)更有效的抗血管生成和抗癌活性[32];JNK1/2 和 p38α分别且彼此独立地调节野生型PEDF及其拟磷突变体的凋亡和抗迁移活性,PEDF 的抗血管生成信号也主要通过激活p38和JNK应激相关激酶发生,与 WT-PEDF 相比,EEE-PEDF增强的抗血管生成和抗癌特性是通过与层粘连蛋白受体的更强的结合及更强的细胞内信号传导效应实现的,JNK和p38 MAPKs信号通路差异调节PEDF的促凋亡和抗迁移活性[33]。P53信号通路参与了CRC细胞增殖、有丝分裂及细胞周期转换的生物过程,也参与了人脐静脉内皮细胞中 PEDF诱导的自噬[34],通过美国癌症基因组图谱(TCGA)数据库识别与PEDF相关的基因,在所有674个预先定义的“Reactome”基因集中,在TCGA直肠癌数据集以及局限性晚期直肠癌队列分析中PEDF的表达均与双链断裂(DSBs)修复通路呈负相关,与G蛋白激活通路呈正相关,使用在线数据库STRING研究PEDF与相关基因之间的相互作用表明了P53是PEDF的下游基因,通过生物信息学分析研究发现PEDF通过激活P53调控双链断裂修复通路和激活G蛋白激活通路发挥抗直肠癌的作用[29]。血管生成刺激剂和抑制剂之间的不平衡可能导致新生血管形成,PEDF可以下调肿瘤细胞VEGF-A的表达和分泌[4],PEDF和VEGF是相互调控的信号,PEDF信号通路可能成为未来的一种辅助治疗工具,可降低IC50剂量、不良反应和治疗成本[31]。虽然CRC中介导PEDF抗肿瘤作用的信号通路机制尚未完全描述,但这仍将是一个有潜力的研究方向。

5 PEDF在CRC中的治疗作用

新辅助放疗可以降低II期、III期局部晚期直肠癌患者的局部复发率,PEDF可作为预测局部晚期直肠癌患者对新辅助放疗反应的生物标志物[29]。对于能耐受化疗的转移性CRC患者,联合化疗是其一、二线治疗[2],但肿瘤的耐药性严重抑制了其治疗效果,结肠癌细胞系对PEDF 衍生肽(CT/CTE)的急性和慢性暴露降低了对常规结肠直肠癌化疗(如奥沙利铂或伊立替康)的耐药性[31]。在CRC全身化疗中,5-氟尿嘧啶是重要组成部分,PEDF联合5-FU用药对CT26结肠癌细胞的治疗有协同作用,且治疗效果比单用5-FU治疗更佳[28]。通过改良的双乳液溶剂蒸发方法,将PEDF和化疗药物紫杉醇(PTX)同时封装在同一纳米颗粒中,双载药纳米粒子(D/P-NPs)对C26和A549细胞具有增强的抗肿瘤作用,在C26皮下肿瘤模型中该种联合疗法也被证明有显著改善抗肿瘤的作用[35]。

靶向药物治疗是适用于大多数CRC患者的一线治疗,PEDF在实体肿瘤的靶向治疗中已取得了一定成效。在体外,靶向癌症的PEDF-DNA脂质体 (R-LP/PEDF) 对CRC细胞的侵袭、迁移和促凋亡具有增强的抑制作用,并且可以减少肺中的转移性肿瘤结节、延长转移性CRC小鼠模型的存活时间[27]。在体内抗肿瘤活性试验中,共载索拉非尼(SORA)与PEDF基因的PEG-PLGA纳米粒的抗肿瘤作用优于单载药纳米粒及游离药物组[36]。将索拉非尼和PEDF封装在基于PEG-PLGA 的纳米粒子中获得共包封纳米粒子(Sora@PEDF-NPs),在急性毒性试验中,Sora@PEDF-NPs 在小鼠体内的毒性低于游离 Sora[37]。

6 总结和展望

研究表明PEDF在CRC中的表达下降,它与肿瘤的恶性程度、临床分期、远处转移呈负相关,PEDF可以通过降低微血管密度、抑制肿瘤血管的生成和肿瘤细胞的增殖迁移、侵袭、转移,诱导肿瘤细胞凋亡,以及介导信号通路对CRC起到抗肿瘤的作用,同时它能降低化疗药物的耐药性,可以作为新辅助放疗反应的生物标志物,并对化疗、靶向治疗、基因治疗起到协同增强作用,且在目前的研究中PEDF安全性良好,未发现PEDF的毒性作用。PEDF在CRC中表达水平的差异性及相关性可能为CRC患者的临床诊断和预后判断提供一定的指导意义,但纵观国内外现有的研究,其研究对象多数采用细胞株、实验动物等,且几乎未涉及大肠息肉及腺瘤等癌前病变,后续的研究中我们可以考虑从正常组织到癌前病变再到大肠癌的PEDF表达情况着手对比分析及研究,从而评估PEDF作为CRC的诊断或评估预后的生物学因子的可行性。同时有必要对PEDF在CRC发展中的调控机制进行进一步研究,以期它可能成为CRC治疗中的新靶点。