胞外囊泡在头颈癌诊断及治疗中的作用

韩善颍,程 林,刘 毅,石 毅,樊建刚

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.耳鼻咽喉头颈外科,b.人力资源部,c.科技部,四川 成都 610072)

头颈癌涉及头颈部区域内的多个器官和组织,通常发生在口腔、鼻咽、喉和鼻腔,是全球第六大最常见的恶性肿瘤,病因主要为烟草、酒精消费和HPV感染等[1～3]。据GLOBOCAN统计,每年大约有600000例新增病例,350000例死亡病例,给社会和公共卫生带来严峻挑战[4]。尽管头颈癌的诊断和治疗方面取得了进步,但总体生存率仍然很低。目前,头颈癌诊断的金标准是组织活检,此侵入性的方法无法确定和监测肿瘤的动态,开发能够连续取样、早期诊断疾病进展和纵向监测治疗反应的“液体活检方法”对于头颈癌的诊断和预后极为重要。细胞外囊泡(extracellular vehicles,EVs)作为液体活检的工具,参与肿瘤发生、生长和发育、免疫反应的逃避、耐药性的发展等过程[6],是诊断头颈癌的新兴策略之一,有望在肿瘤基因组和突变的表征方面方面得到广泛的应用。EVs还提供可重复性的实时治疗监测和可行性预估,同时具有微创性和成本效益[5]。

1 EVs

1.1 EVs的特征和组成EVs在结构上与其起源细胞相似,具有脂质双层结构,其内含物包括脂质、蛋白质、DNA、RNA(miRNA等)和代谢物等生物活性分子。EVs由细胞释放至细胞外空间和液体中后[7,8],被有效地递送至受体细胞,从而生成通信网络。EVs内含物可以作用于受体细胞,重塑周围的微环境并改变远处的目标,影响其生物学行为。

1.2 EVs的生物发生EVs是由多种类型的细胞产生并释放到细胞外基质中的30 nm至1 μm的膜囊泡,稳定广泛存在于各种体液中,如血浆、唾液、脑脊液、母乳、尿液、精液、淋巴液、滑膜液、羊水和痰液等。EVs的生物学起源始于早期内体,它通过质膜内陷形成。在此过程中,细胞外成分和细胞膜蛋白被包裹起来,早期内体膜的向内出芽导致囊泡的形成。早期内体不仅与其他细胞器交换物质,而且与不同的内体融合形成晚期内体。具有管腔内囊泡的晚期核内体——多泡体,它们负责与细胞膜融合以将EVs释放到细胞外环境中[9,10]。

1.3 EVs的优势① EVs 由肿瘤和其他细胞主动释放,而不是由于细胞凋亡而被动释放[11];②由于脂质双分子层的保护,EVs及其内容物相对稳定[12];③ EV 体积小,对细胞外基质具有高渗透性[13];④EVs由一系列分子内含物组成,有利于发现肿瘤特异性生物标志物[14]。EVs反映细胞的动态及实时变化,随着精准化、个体化治疗的推进,EVs使提高预后和治疗效果的评价及推动抗肿瘤新药的研发成为可能[15]。

1.4 EVs分离和表征方法

1.4.1EVs分离方法 目前较常采用的EVs分离策略主要是基于EVs的大小、形状、表面电荷、密度和孔隙率、表面抗原等物理化学特性进行EVs的分离,包括超速离心、基于尺寸的过滤、尺寸排阻色谱、聚合物沉淀、免疫亲和捕获法和基于微流体的分离方法[16]。

1.4.2EVs表征技术 许多技术已常规用于表征EVs,其中,使用表面蛋白标记 CD9、CD63、CD81、Alix、TSG101的蛋白质印迹和流式细胞术是最常用的EVs表征分析方法[17,18]。通过透射电子显微镜可以表征EVs的形态和形状,利用纳米粒子跟踪分析 (NTA)表征EVs大小[19]。此外,可调电阻脉冲传感、ELISA分析、扫描电子显微镜和原子力显微镜也是常用的EVs表征技术[20]。

2 EVs作为潜在生物标志物来源在头颈癌诊断中的作用

因其双层结构、生物相容性、低免疫原性以及与靶细胞相互作用的能力,EVs被公认为潜在的头颈癌生物标志物来源。据报道,EVs影响头颈癌生长,参与头颈癌侵袭和转移,调节头颈癌肿瘤微环境,促进头颈癌的耐药性产生。作为调控头颈癌细胞的生物学行为和头颈癌细胞动态实时变化的监测窗口,EVs发挥功能的主要内含物则是其内部封装的DNA(EVs-DNA)、RNA(EVs-RNA)和蛋白质(EVs-蛋白质)。

2.1 EVs-DNA在头颈癌中的生物标志物潜力EVs-DNA中的基因组DNA包括单链和双链和线粒体DNA (mtDNA)[21]。近来一项对来自胰腺癌患者血清的成对肿瘤组织和CD63+/TSG101+EVs的开创性研究报告称,EVs-DNA 覆盖了整个基因组,并携带与亲本肿瘤相同的突变。此外,EVs-DNA似乎可以通过主动运输的方式,影响相应的mRNA和蛋白质水平,进而影响细胞功能。其还反映了亲本肿瘤细胞的突变状态,而无需直接肿瘤取样。基于此研究结果开发了一种名为 ExoDx EGFR的EV 检测方法,该方法使用qPCR检测EVs-DNA中的EGFR突变[22～24],具有高灵敏度和特异性。头颈癌经常以EGFR突变为特征,未来的研究也在致力于利用ExoDx EGFR进行EVs-EGFR突变的早期检测和西妥昔单抗(一种针对EGFR的单克隆抗体)治疗晚期头颈癌的疗效评估,试图通过这种非侵入性的检测方式,找寻相关的头颈癌生物标志物,为临床管理和用药提供信息。

2.2 EVs-RNA在头颈癌中的生物标志物潜力近年来,EVs-RNA在头颈癌中的作用主要聚焦于EVs内含物——非编码RNA(miRNA)的研究。EVs-miRNA作为参与头颈癌的必需调节分子,是一类长度约为20个核苷酸的单链非编码短RNA分子,通过形成RNA诱导的沉默复合物降解靶基因的mRNA,在调节头颈癌各种生理和病理过程中发挥重要作用,可作为头颈癌疾病生物标志物并可能发展为头颈癌新的治疗靶点。因为EVs-miRNA具有稳定性并且能够调节癌基因和抑癌基因,已成为头颈癌患者早期诊断、预后和治疗靶标的潜在生物标志物。近来已在包括头颈癌在内的各种癌症类型中探索了EVs-miRNA相关的生物标志物潜力[25]。

2.2.1miR-21 在EVs中富集的miR-21是一种致癌miRNA,靶向与增殖、凋亡和侵袭相关的肿瘤抑制基因,在共培养后可以从肿瘤细胞水平转移到人类单核细胞。EVs相关miR-21已被证明能够反映口腔癌患者肿瘤的实时表达状态,暗示了其作为生物标志物的潜力[26]。miR-21的生物标志物潜力也在区分恶性喉癌和良性疾病中得到了验证,miR-21表达水平的差异与临床参数相关。此外,在缺氧环境中,缺氧诱导因子(HIF)-1α和HIF-2α能够促进EVs中更高水平的致癌miR-21的表达,从而介导口腔鳞状细胞癌的转移和侵袭。当HIF-1α和HIF-2α被敲除时,EVs中miR-21的表达恢复到原始水平,从而抑制口腔鳞状细胞癌的转移和侵袭[27]。据Momen-Heravi和Bala报道,miR-21可以激活炎症途径,尤其是激活NF-κB,这可以上调炎症细胞因子如IL-6、PGE2、MCP1和MMPs,进而促进肿瘤转移。血清EVs-miR-21的表达与头颈癌的淋巴结转移和肿瘤分期等临床参数有关,但在促进肿瘤分化方面没有发现明显差异[28]。

2.2.2miR-24-3p 除了miR-21,与健康对照相比,EVs相关的miR-941也显示在喉癌患者的血浆中高表达[29]。另一项研究表明,miR-24-3p是与口腔癌患者唾液中的CD9+EVs相关的最显着上调的miRNA之一[30],这与miR-24-3p在口腔癌细胞中的功能一致,即miR-24-3p能够产生“肿瘤友好”的微环境,通过调节细胞周期相关基因的表达来促进癌细胞增殖,且ROC分析显示EVs-miR-24-3p可以显着区分口腔癌患者和正常的对照组,并具64.4% 的敏感性和80%的特异性。EVs-miRNA-34a-5p过表达可通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路促进口腔鳞癌的进展,从而诱导上皮-间质转化,促进癌细胞转移[31]。

2.2.3EVs-miR-196a 头颈癌患者血浆中EVs-miR-196a的表达水平高于健康供体,并且在肿瘤切除后减少,表明EVs-miR-196a是被头颈癌肿瘤组织释放的。较高的EVs-miR-196a与头颈癌患者的耐药性和较差的总生存期相关。通过监测血浆EVs-miR-196a水平,可以将患者分为化疗耐药组和化疗敏感组,灵敏度高达85%,特异性约为70%。上述研究表明,血浆EVs-miR-196a可作为头颈癌患者的预后因素和化疗耐药性预测因子[32]。miRNA-491-5p 治疗前后的动态变化与1年疾病复发率(80%的敏感性和69.23%的特异性)以及无病生存率和总体生存率相关,生存率分别为2.82和5.66,这一发现可能有助于识别肿瘤复发风险高的患者[33,34]。

2.3 EVs-蛋白质在头颈癌中的生物标志物潜力在EVs中,蛋白质组在脂质双层中得到了很好的保护,并且可以在生物体体液样本中得以完整保存。此外,EVs中特异的蛋白质信息可以反映蛋白质组特征的变化[35]。通过近年来研究,EVs-蛋白质在头颈癌中的关键作用已取得重大进展。多项研究发现EVs中的一些蛋白质,包括CD9、小窝蛋白1(CAV1)和肿瘤排斥抗原1(gp96),在头颈癌中具有诊断价值[36]。Ono等发现,与未转移的肿瘤细胞相比,口腔鳞癌癌症细胞发生淋巴结转移时,EVs中CD9和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的表达水平较高,这表明CD9和EpCAM的分泌促进了口腔鳞癌的恶性进展。EGFR和PD-L1已被报道为头颈癌潜在生物标志物,CD44已成为头颈癌的作用诊断候选物。CD44v3在头颈癌中的过度表达与增殖、迁移和转移潜能增强以及预后不良有关。基于此,最近的一项研究表明,头颈癌患者血浆EVs中CD44v3的表达水平与头颈癌疾病分期、淋巴结转移和免疫功能障碍相关[37]。其他有针对性的研究表明,赖氨酰氧化酶样2和亲环蛋白A表达水平升高与头颈癌患者血浆中的EVs相关,并与疾病状态相关[38,39]。富含微纤维相关蛋白5(MFAP5)通过激活由EVs介导的MAPK和AKT通路,促进口腔舌鳞状细胞癌细胞的生长和迁移[40]。此外,来自转移性肿瘤细胞的EVs含有丰富的HSP90,这与HSP90α和HSP90β基因敲除后癌症细胞数量的下降一致;这些发现表明HSP90的表达增加是口腔鳞状细胞癌的不利预后因素。因此,HSP90在EVs中的表达可以成为口腔鳞状细胞癌的潜在预后标志物和治疗靶点[41]。

3 EVs作为头颈癌药物治疗载体在抗癌治疗中的前景

EVs作为各种分子的内源性纳米载体,由于其免疫原性低、跨越生理屏障的能力强、固有的靶向能力、良好的生物分布和生物利用度,正在成为化疗药物的药物输送载体[42～45]。研究表明,EVs递送的miRNA-138在体外和体内有效赋予口腔鳞状细胞癌抗肿瘤功能,支持EVs在头颈癌中也具有作为递送剂潜力的假设[46]。Cohen等评估了间充质干细胞分泌的外泌体(MSC-exo) 和A431鳞状细胞癌细胞 (A431-exo) 的外泌体作为药物载体的参数,发现 MSC-exo在A431荷瘤小鼠中表现出明显更大的肿瘤渗透能力[47]。姜黄素是姜黄的生物活性成分,具有较好的抗癌作用[48]。最近研究表明,姜黄素、多柔比星和紫杉醇可以被加载到EVs中,以提高其治疗效果。研究者将姜黄素加载到白色念珠菌分泌的EVs中,然后将其转移到口腔舌鳞状细胞癌细胞系中,并将其与未加载的姜黄素细胞系进行比较,研究结果显示,EVs中姜黄素的添加提高了生物利用度[49]。以上的研究结果皆表明,EVs可被发展为优异的治疗载体,在头颈癌抗癌治疗中具有广阔的应用前景。

总而言之,EVs研究是一个有吸引力的新兴领域,其优势取决于它们内含物的“信号箱”作用,这些EVs内含物可以通过多组学检测识别和评估早期检测头颈癌的各种生物标志物。基于头颈癌中EVs的液体活检方法,不仅可以评估恶性程度和肿瘤进展,还可以为头颈癌的治疗提供适当的方法和监测。EVs相关的临床研究已取得显著的进展,可以促进头颈癌癌细胞的增殖和转移,以及癌细胞的免疫逃逸或耐药性产生。尽管这些研究促进了EVs在头颈癌诊断中的临床应用,但仍有许多问题需要进一步阐明。由于EVs在癌症发生中的关键作用,需要在该领域进行更多的研究,以探索EVs在肿瘤治疗中的潜力。