八味通里颗粒的质量标准研究

赵昱玮 司学玲 任 辉 张瀚水 龚本义 南敏伦 赫玉芳 赵红菲

1.长春中医药大学附属医院制剂中心，吉林长春 130117；2.修正药业集团长春高新制药有限公司质量管理部，吉林长春 130012；3.吉林大学中日联谊医院普外科，吉林长春 130033；4.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130021；5.吉林省中医药科学院植物化学研究所，吉林长春 130012；6.长春中医药大学健康管理学院，吉林长春 130117

八味通里颗粒由大黄、芒硝、炒莱菔子、厚朴、枳壳、槟榔、地黄、枳实组成。取自汉代《伤寒论》“大承气汤”加减而成。具有通腑泄热、滋阴润燥、行气活血的功效。用于阳明腑实所致大便秘结不通、脘腹胀满、疼痛拒按、高热神昏、谵语、口干舌燥，舌红苔黄腻，脉滑数属。可用于术后肠梗阻、单纯性肠梗阻、粘连性肠梗阻、急性胆囊炎、急性胰腺炎、急性阑尾炎等见上述侯证候者。方中大黄[1-2]苦寒泻热，祛瘀通便，荡涤肠胃邪热积滞，消除致病之因，用为君药。芒硝[3-4]咸苦而寒，泻热通便，润燥软坚，协大黄则峻下热结，用为臣药。积滞内阻，腑气不通，内结之积滞恐难速下，重用厚朴、枳壳、炒莱菔子、枳实、槟榔行气宽中，消胀除满，燥屎热结伤阴故使以生地滋阴润燥养血[5-14]。共成通腑泄热、滋阴润燥，行气活血之功效。

为了更好地控制该制剂的质量，本研究对八味通里颗粒中的炒莱菔子、大黄、槟榔进行薄层色谱法（thin-layer chromatography，TLC）鉴别，并通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定枳壳和枳实中新橙皮苷的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪（Agilent）；KQ2200DE型超声波清洗器（昆山舒美）；QUINTIX125D-1CN型电子天平（德国Sartorius公司）。

1.2 试药

芥子碱硫氰酸盐、大黄素、大黄酚、新橙皮苷对照品（批号分别为111702-202006、110756-201913、110796-201922、111857-201804，纯度分别为99.0%、96.0%、99.4%、99.4%，中检院）。乙腈（色谱纯，Sigma），薄层板为青岛海洋化工厂分厂生产，其他试剂均为分析纯（AR）。八味通里颗粒（批号：20210901、20210902、20210903，吉林大学中日联谊医院）。

2 试验方法

2.1 薄层鉴别

2.1.1 炒莱菔子 称量研细后的八味通里颗粒3 g于具塞锥形瓶中，加25 ml无水乙醇，在50℃条件下超声40 min，置冷水中冷却后滤过，回收乙醇提取液，残渣用乙酸乙酯浸泡2次，10 min/次、每次20 ml，分离并弃去乙酸乙酯液，残渣挥干，加1 ml甲醇溶解，作为供试品溶液。莱菔子对照药材，磨成细粉，称取0.5 g，加水20 ml，按照供试品制备方法制成对照药材溶液。精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品适量，加甲醇制成1 mg/ml的溶液，作为对照品溶液。照《中国药典》2020年版四部通则0502 TLC试验，吸取上述三种溶液各3～6 μ1，分别点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（20∶4∶6）放置分层的上层溶液为展开剂，于上行展开缸中展开后，取出，晾干，放置在三用紫外分析仪上在365 nm下观察。供试品色谱中，在与对照药材及对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图1。

图1 炒莱菔子薄层色谱图

2.1.2 大黄 取八味通里颗粒3 g，研成细粉，加入25 ml甲醇，在50℃条件下超声30 min，放置至室温，滤过，滤液回收溶剂至干，加去离子水10 ml、浓盐酸1 ml，100℃加热回流水解30 min，冷却后，用三氯甲烷提取水解液2次，每次10 ml，合并两次三氯甲烷液，挥干溶剂，残渣加1 ml甲醇溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材细粉0.1 g，按照供试品的制备方法制成对照药材溶液。再取大黄素、大黄酚适量，加三氯甲烷制成每1 ml分别含0.5 mg的溶液，为对照品溶液。照《中国药典》2020年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各1～3 μ1，点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（60℃～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（30∶10∶2）放置的上层溶液为展开剂，于上行展开缸中展开后，取出，自然晾干，放置在三用紫外分析仪上在365 nm下观察。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图2。

图2 大黄薄层色谱图

2.1.3 槟榔 取八味通里颗粒10 g，研成细粉，先加入2 ml浓氨试液，搅拌使粉末润湿、再加入40 ml三氯甲烷，摇匀，放置30 min，超声30 min，分取三氯甲烷液，用盐酸（1→5）溶液30 ml，振摇提取，取盐酸水层，用氨试液调节pH=9，再用三氯甲烷振摇提取2次，每次30 ml，合并三氯甲烷液，挥干，残渣加1 ml甲醇搅拌使溶解，为供试品溶液。另取槟榔对照药材粉末l g，按照上述供试品制备方法制成对照药材溶液。照《中国药典》2020年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5～10 μl，点于同一羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-浓氨试液（15∶15∶0.2）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，上行展开都，取出，自然晾干，置放置碘的密闭空间中显色。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图3。

图3 槟榔薄层色谱图

2.2 新橙皮苷含量测定

2.2.1 色谱条件 分析柱为ACE-C（184.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.25%磷酸溶液（19∶81）为流动相，检测波长283 nm，流速0.9 ml/min，柱温25℃，进样量10 μl。见图4。

图4 HPLC色谱图

2.2.2 八味通里颗粒供试品溶液的制备 取八味通里颗粒，用研钵研成细粉，取约1 g，精密称重，置具塞锥形瓶中，加甲醇溶液25 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）60 min，放置至室温，称重，加甲醇溶液补量，振荡均匀，滤过（0.2 μm），取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液制备 精密称取新橙皮苷对照品适量，加甲醇超声溶解，制成含新橙皮苷质量浓度约为105 μg/ml的溶液。

2.2.4 线性关系考察 取对照品溶液各2、4、8、12、16、20 μl，分别利用液相色谱仪进行测定，横坐标（X）为新橙皮苷的进样量（μg），纵坐标（Y）为新橙皮苷的峰面积（A），绘制标准曲线，线性方程为Y=1496.2X-31.92，r=0.9998，结果表明，新橙皮苷含量在0.21～2.10 μg范围内线性良好。

2.2.5 精密度试验 取八味通里颗粒同一供试品溶液（20210902），照“2.2.1”色谱条件连续测定6次，新橙皮苷峰面积的RSD为0.65%（n=6），说明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取八味通里颗粒（20210902），照“2.2.2”制备6份供重复性测定用的供试品溶液，照“2.2.1”色谱条件进行测定，新橙皮苷含量的平均值为1.61 mg/g，RSD为1.15%（n=6），说明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取八味通里颗粒（20210902）同一供试品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h各进行测定，新橙皮苷峰面积RSD为1.48%，说明样品在24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率考察 取八味通里颗粒（20210902）6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.8220 mg/ml新橙皮苷对照品1 ml，制备供试品溶液，按色谱条件测定，实验结果如表1。计算得到新橙皮苷的平均回收率为99.91%，RSD为0.43%。

表1 加样回收率实验结果

2.2.9 含量测定 取20210901、20210902、20210903批次八味通里颗粒样品，按照“2.2.2”下方法制备供试品并进行检测，3批颗粒新橙皮苷含量分别为1.58、1.61、1.60 mg/g，平均含量为1.60 mg/g。按照新橙皮苷不低于80%计，八味通里颗粒中新橙皮苷的含量应不低于1.20 mg/g。

3 讨论

3.1 薄层鉴别

对八味通里颗粒中各药味进行了摸索，最终建立了炒莱菔子、大黄、槟榔的薄层鉴别方法。参考《中国药典》2020年版一部及参考文献[15-20]中的薄层鉴别方法，对八味通里颗粒中炒莱菔子、大黄、槟榔鉴别方法进行优化，确定了最优的薄层色谱条件。

3.2 含量测定

①分别考察了甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液流动相系统[21-24]，考察了ACE-C18、Agilent ODS-C18、Hypersil ODS-C18色谱柱，考察了不同的检测波长、柱温的影响，最终确定分析柱为ACE-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.25%磷酸溶液（19∶81）为流动相，检测波长283 nm，流速0.9 ml/min，柱温25℃，进样量10μl的色谱条件。②以提取的新橙皮苷含量为评价指标，对提取的溶剂（分别设定甲醇和乙醇）、提取溶剂用量（25、50 ml）、提取的方式（超声提取、加热回流提取）、提取时间（30、60、90 min）进行考察，最终确定的提取方法为甲醇25 ml，超声处里60 min。最终建立的HPLC测定八味通里颗粒中新橙皮苷含量专属性强、重复性好，结果可靠。

本研究建立了八味通里颗粒中炒莱菔子、大黄、槟榔的定性鉴别方法和新橙皮苷的HPLC含量测定方法，方法简便操作性强，可用于八味通里颗粒的质量控制提供依据。