王 琳 孙 琳 董 燕 陈亚慧 王亚楠
1.济宁医学院临床医学院,山东济宁 272013;2.济宁医学院附属医院妇三科,山东济宁 272029
子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)的发生是一个多步骤的过程,涉及前体病变与表观遗传,其生物学、临床、组织学和遗传特征均有明显的异质性。近年来,子宫内膜癌的发病率随着人口老龄化与肥胖率的增加而上升,经阴道超声在鉴别良性、恶性子宫内膜病变方面仍然不足,其特异性在有症状的妇女中为36%~68%[1],且并非所有子宫内膜恶性肿瘤都伴有子宫内膜增厚。传统的病理特征,如组织病理类型、分级、子宫肌层浸润和淋巴血管间隙浸润,在评估预后方面具有重要的作用,但仍表现出一定的差异[2]。因此,迫切需要新的生物标志物单独使用或与当前的以细胞病理学为基础的方法联合用于EC的早期诊断与预后风险评估。
Paired box(PAX)基因是在脊椎动物和无脊椎动物中发现的高度保守的转录因子家族,从20世纪80年代末开始,随着现代分子生物学技术的出现,研究人员开始研究一类包含“配对”DNA结合区域的转录因子,这些在生物体发育过程中具有调节基因转录能力的蛋白质被称为“主调控因子”配对框蛋白,不同的配对框蛋白活性参与不同恶性肿瘤的发生,现被认为是癌症进展的重要因素[3]。
PAX基因家族在促进细胞增殖、迁移、存活以及在胚胎组织发育和细胞分化中起到重要作用,PAX基因突变与多种人类疾病相关(如小眼症、无眼症、缺损、甲状腺功能减退、急性淋巴细胞白血病)[4]。已知人类和其他哺乳动物在各自的单倍体基因组中拥有9个PAX基因(PAX1~PAX9)。然而,在其他脊椎动物中,PAX基因的数量是不同的,从鸟类和一些爬行动物的7个到斑马鱼的15个,人类的9个PAX基因位于8个不同的染色体上,八肽连接子或部分或全同源域(homeodomain,HD)的存在将PAX蛋白细分为四组[5-6]:Ⅰ组为PAX1、PAX9;Ⅱ组为PAX2、PAX5、PAX8;Ⅲ组为PAX3、PAX7;Ⅳ组为PAX4、PAX6,其中Ⅰ组缺乏HD,表明HD不是其DNA结合所必需的。PAX蛋白在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组包含部分或全同源DNA结合域,这允许他们结合和调节独特的基因靶标亚群。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的PAX蛋白均包含一个八肽连接器,可以通过辅因子结合来控制PAX蛋白的反式激活。
1.2.1 PAX1 PAX1基因位于染色体20p11.2,参与人类的骨骼、甲状旁腺和胸腺的发育。PAX1启动子的甲基化是一种重要的表观遗传调控,多种肿瘤的发生相关,如宫颈癌[7-8]、口腔鳞癌[9]、食管鳞状细胞癌[10]、EC[11]等,并且对这些肿瘤的诊断具有较好的敏感性和特异性。
PAX1基因在检测宫颈上皮内肿瘤CIN3级及更严重病变(CIN3+)方面有应用前景,其敏感性和特异性均大于80%,结合宫颈细胞细胞学或HPV 16、18基因分型,可以显著提高检测宫颈癌的准确性,PAX1基因的甲基化已被认为是宫颈癌筛查的潜在生物标志物[8,12]。Cheng等[9]的研究表明口腔癌组织中PAX1基因的甲基化水平显著高于邻近正常口腔黏膜组织(P< 0.01),Kaplan-Meier生存曲线显示PAX1阳性的口腔鳞癌患者3年总生存期较PAX1阴性患者明显缩短(P=0.02),从而证实PAX1甲基化与口腔鳞癌的侵袭性进展和不良预后有关。已知PAX1启动子在食管鳞状细胞癌中呈高度甲基化,在致癌应激源、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等致癌细胞因子表达时,PAX1可能作为一种肿瘤抑制因子,通过与H3K4甲基转移酶、H3K9/DNA去甲基酶的合作上调多种磷酸酶基因的表达,包括蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型R(protein tyrosine phosphatase receptor type R,PTPRR) 和双特异性磷酸酶(dual-specificity phosphatases,DUSPs)(DUSP1、DUSP5、DUSP6),从而抑制EGF和IL-6介导的致癌信号激酶的激活[4,7,13]。此外,癌症靶向治疗的耐药性是一个难题,酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)在肺癌中显示出显著的治疗效果,然而,患者经常对治疗产生耐药性,代偿性致癌激酶级联反应,例如MAPK、PI3K/AKT和SRC/AKT通路,可能会使TKIs无效,而PAX1激活的磷酸酶可以抑制多种MAPK途径和SRC激酶,由此可见,PAX1的重新激活磷酸酶可能是抑制多种致癌激酶通路的一种策略,可以解决肿瘤治疗过程中耐药性的问题[7]。
1.2.2 PAX2 PAX2是小鼠神经形成过程中最早表达的PAX基因,该基因突变可致其编码产物的功能异常,进而导致肾、眼等器官发育不良[14]。PAX2在肾脏发育过程中的暂时性表达,引起了研究者们的注意,在人肾癌细胞系中,抑制PAX2可加速细胞凋亡,降低细胞增殖,并使细胞对其他化疗药物敏感,即靶向PAX2可能是一种可行的抗肾癌治疗方法[14]。其他肿瘤,包括乳腺癌[15]、卵巢癌[16]、Wilms瘤[17]等,都与PAX2有关系。大约70%乳腺癌为雌激素受体(estrogen receptor,ER)α阳性,研究表明PAX2和他莫昔芬通过维持肿瘤抑制因子的高水平转录来共同发挥抗肿瘤作用[15],PAX2通过抑制ER阳性(ER+)乳腺癌中ERBB2/HER2的转录而成为乳腺癌治疗的关键靶点。在自发性卵巢表面上皮来源的高级别浆液性卵巢癌模型中,PAX2通过增加环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)和减少丝氨酸蛋白酶1(htrA serine peptidase 1,HTRA1)的表达来降低癌细胞的增殖和转移,突出了PAX2对肿瘤的抑制作用[16]。
1.2.3 PAX8 PAX8在身体不同器官中发挥重要作用,特别是甲状腺[18]、肾脏和苗勒氏导管系统[19]。免疫组织化学染色被用于检测不同上皮癌中PAX8的表达,并将他们与 PAX8 阴性肿瘤区分开来。PAX8基因功能异常可导致多种甲状腺疾病,包括甲状腺功能减退、滤泡性甲状腺腺瘤和甲状腺癌的发生,在甲状腺滤泡癌中,t(2;3)(q13;p25)染色体易位致PAX8基因与过氧化物酶体增殖物激活受体γ融合产生融合蛋白PPFP[20-21],使之成为甲状腺癌治疗的新靶点。Bleu等[22]发现PAX8是肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞中的致癌基因,Ozcan等[23]进一步证实了这一观点,美国RCC患者中PAX8阳性率为82%~89%,提示PAX8可作为诊断工具,在临床诊断RCC中发挥支持作用。
大多数EC进展缓慢,患者往往在确诊前数月就有异常阴道流血的症状,这为早期诊断与治疗提供了机会[24]。Ⅰ型EC大多由子宫内膜不典型增生(atypical hyperplasia,AH)发展而来[25],术前基于有限的组织样本病理检查来鉴别AH与EC具有一定的挑战性,约17%~50%因AH行子宫切除患者术后证实为EC[26],因此,有必要开发新的、基于分子的、补充的工具,以改善病理诊断。
由于子宫颈和子宫内膜都起源于苗勒氏导管系统,在宫颈癌中发生高甲基化的PAX1基因在EC中也可能发生了高甲基化。Liu等[11]进行了一项回顾性研究,对201例子宫内膜标本进行免疫组织化学染色,结果表明PAX1在正常子宫内膜(93.3%)、单纯性增生子宫内膜(97.2%)和不典型增生子宫内膜(87.5%)中表达较高,而在EC中仅有30.1%表达,AH患者组织中PAX1蛋白表达水平显著高于EC组(P< 0.001),且与总体存活率成正比。可见PAX1蛋白可能在子宫内膜样癌的发生发展中起重要作用,PAX1基因作为抑癌基因,在癌组织中的表达降低是癌症形成的重要因素。PAX1蛋白表达可作为子宫内膜癌与癌前病变鉴别诊断的潜在组织病理学标志物,似乎也可能是评估EC患者预后的重要因素。因此,有必要进行更大规模的前瞻性研究来证实,并评估PAX1用于区分复杂的不典型增生合并和不合并子宫内膜癌的可能性。
众所周知,雌激素在子宫内膜癌的发生、生长、侵袭和转移中具有重要意义,雌二醇(E2)通过激活ERα和ERβ发挥功能,有研究证实,PAX2是子宫内膜细胞中ERα的下游靶标,E2通过ERα激活PAX2基因,从而促进EC细胞的生长[27]。他莫昔芬作为激素反应型乳腺癌首选治疗药物,在子宫中显示出部分雌激素活性,Wu等[28]将EC细胞株(ECC-1)种植到去卵巢小鼠体内,在PAX2表达不变的情况下,接受E2或他莫昔芬治疗的小鼠肿瘤生长显著超过未接受治疗小鼠,在PAX2过表达的ECC-1肿瘤移植的无瘤小鼠中,也可以观察到肿瘤的显著增长,雌激素或他莫昔芬治疗进一步促进了肿瘤的生长,而PAX2基因敲除组小鼠,雌激素和他莫昔芬对肿瘤生长的刺激作用大大减弱,这些实验足以表明,PAX2是雌激素和他莫昔芬刺激子宫内膜癌生长的关键效应器。
Raffone等[16]指出EC和癌前病变患者内膜中PAX2的表达完全缺失和表达降低显著高于正常子宫内膜,Colina等[29]也得出类似结论,正常内膜组织、癌前病变和EC组织中,PAX2蛋白表达水平逐渐降低,分别为64%、29%和23%,这似乎表明了PAX2基因在子宫内膜癌发生中的抑癌作用。建立PAX2敲低和过表达子宫内膜细胞系[30],PAX2基因的下调能够抑制细胞增殖、迁移、侵袭能力,并导致细胞的G2/M期停滞,而PAX2的过表达则可促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭和G1-S转变。
鉴于以上研究发现可能表明PAX2基因在子宫内膜癌的发生发展中具有双重作用(肿瘤抑制基因和致癌基因),因此,仍需要进一步的研究来证实和验证这些结果。
PAX8是女性生殖道前体组织苗勒氏系统的关键转录因子,Fu等[31]使用PAX8-rtTA Tre-Cre Ai9小鼠的谱系追踪显示,PAX8在成年小鼠整个发情周期持续表达,主要存在于子宫内膜上皮细胞而非基质细胞中,是维持子宫内膜上皮细胞稳态再生的主要贡献者。研究发现PAX8基因在子宫浆液性癌(uterine serous carcinomas,USC)中表达上调。USC约占子宫内膜癌的3%~10%,通常呈高度恶性,具有深肌层侵袭(myometrial invasion,MI)、淋巴血管侵袭(lymphovascular invasion,LVI)和更具侵袭性的临床症状。
一项由229例EC患者参与的研究显示[32],子宫浆液性癌和透明细胞癌以及癌肉瘤中的PAX8表达程度高于子宫内膜样腺癌,且与高肿瘤分级、LVI和MI相关,PAX8阳性患者的总体存活率为55.9%,而PAX8阴性患者为80.04%。另一项对97名原发性EC患者进行了为期10年的随访研究表明[18],PAX8阳性表达与非子宫内膜样癌(Ⅱ型)和高级别癌显著相关,人类p53基因在其第一外显子中含有一个PAX结合位点,该结合位点在整个进化过程中都是保守的,PAX8能够抑制p53启动子反式激活,直接或间接地影响p53的表达或功能,从而在EC的发展中起到抗细胞凋亡的作用。
综上所述,PAX8阳性表达的EC患者临床预后更差,表明其可能是EC患者预后不良的潜在生物标志物,抑制PAX8的活性可能对癌症治疗产生重大影响,Ⅱ型EC对传统化疗具有耐药性,因此进行针对性的靶向治疗以沉默PAX8可能是一种很有前途的治疗选择。
PAX蛋白是正常的器官形成和组织稳态所必需的,其作用机制复杂,在人类不同肿瘤中发挥促进或抑制肿瘤的功能,与EC的发生有着密切关系。尽管临床对PAX基因有丰富的了解,但仍需进行大规模临床研究来评估PAX基因对EC早期诊断与预后评估的功效。