宣肺止嗽合剂微生物限度检查方法的建立研究

刘 荔 李 岩 俞树花 朱建宁

甘肃省药品监督管理局审核查验中心 （甘肃省疫苗检查中心），甘肃兰州 730070

宣肺止嗽合剂具有疏风宣肺、止咳化痰的功效，是由荆芥、前胡、桔梗、蜜百部、蜜紫菀、陈皮、鱼腥草、薄荷、蜜罂粟壳和蜜甘草提取制成的一种非无菌中成药[1]。依据《中华人民共和国药典》2020年版四部的规定[2]，需要先开展针对该药的方法适用性试验，以验证所采用的方法是否可用于该产品的检查；并建立出适用于该药微生物限度检查的方法，以用于评价药物受微生物污染的程度。本研究针对宣肺止嗽合剂，考察了平皿法和薄膜过滤法对需氧菌总数计数的适用性，平皿法对霉菌和酵母菌总数计数的适用性，常规法和增加培养基体积法对控制菌检查的适用性，最终建立了一种适用于该药微生物限度检查的方法。本研究也为相关药品质量控制部门，进行该药品的微生物分析和质量分析提供了重要参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ClassⅡ BSC二级生物安全柜（新加坡Esco公司），ML6001T电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），IN160恒温培养箱（德国Memmert公司），MJ-70-I霉菌培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2 样品

宣肺止嗽合剂规格为120 ml/瓶，批号为CP009210501，由甘肃某药厂生产。

1.3 培养基及试验菌株

试验所用培养基的适用性检查均符合《中华人民共和国药典》2020年版四部的规定[2]；所用试验菌株均购自中国食品药品检定研究院，工作菌株均为第3代。

2 方法

参照《中华人民共和国药典》2020年版四部1105和1106描述的微生物限度检查法[2]，进行试验。

2.1 试验用菌液的制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌分别接种在胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24 h；将白色念珠菌接种在沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养48～72 h。之后用无菌pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（以下简称“稀释液”），将上述菌株新鲜培养物分别稀释成含菌量≤1000 cfu/ml的菌液。将黑曲霉接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上，20～25℃培养5～7 d，直至孢子明显生成。用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的稀释液将黑曲霉孢子洗脱，稀释成含菌量≤1000 cfu/ml的菌液。

2.2 供试液制备

在无菌锥形瓶中，量取宣肺止嗽合剂原液10 ml，加入稀释液充分混匀，制成1∶10的供试液。

2.3 微生物计数方法的适用性试验

2.3.1 平皿法 在需氧菌总数计数的试验中，取宣肺止嗽合剂原液9.9 ml，加入“2.1”项下某一菌液0.1 ml混匀，作为试验组；以稀释液代替菌液，作为供试品对照组；以稀释液代替宣肺止嗽合剂原液，作为菌液对照组。

在霉菌和酵母菌总数计数的试验中，取“2.2”项下1∶10的供试液9.9 ml，加入“2.1”项下的白色念珠菌或黑曲霉菌液0.1 ml混匀，作为试验组；以稀释液代替菌液，作为供试品对照组；以稀释液代替1∶10的供试液，作为菌液对照组。

取上述试液各1 ml注皿，倾注15～20 ml胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，按药典规定培养、进行菌落计数测定，每组平行3皿。

2.3.2 薄膜过滤法 取宣肺止嗽合剂原液9.9 ml，加入“2.1”项下的金黄色葡萄球菌或枯草芽孢杆菌0.1 ml混匀，作为试验组；以稀释液代替菌液，作为供试品对照组；以稀释液代替宣肺止嗽合剂原液，作为菌液对照组。取上述试液1 ml至100 ml稀释液中混匀，经滤膜过滤后转移滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上，按药典规定培养后进行菌落计数测定，每组平行3皿。

2.4 试验菌回收比值计算

试验菌回收比值=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液对照组平均菌落数

2.5 控制菌检查法的适用性试验

2.5.1 常规法 在100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，加入“2.2”项下1∶10供试液10 ml，混匀后作为供试品组；加入“2.2”项下1∶10供试液10 ml和“2.1”项下大肠埃希菌的菌液0.1 ml，混匀后作为阳性对照组；加入稀释液10 ml，混匀作为阴性对照组。按药典规定培养，接种后进行大肠埃希菌的检查，每组平行3皿。

2.5.2 增加培养基体积法 除将胰酪大豆胨液体培养基由“2.5.1常规法”中的100 ml换为200 ml外，其余均与“2.5.1”相同。

3 结果

3.1 微生物计数方法的适用性

依照《中华人民共和国药典》2020年版四部1105的规定：微生物计数包含需氧菌总数的测定、霉菌和酵母菌总数的测定；计数方法适用性试验中，釆用平皿法或薄膜过滤法时，试验菌的回收比值应在0.5～2.0范围内；若各试验菌的回收试验均符合要求，则可采用所用的供试液制备方法和计数方法[2]。

对需氧菌总数计数的适用性试验，本研究分别釆用了平皿法和薄膜过滤，两种方法中均以宣肺止嗽合剂原液为供试液。平皿法对各菌株的回收比见表1，可看出对铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收比均处于0.5～2.0，然而对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收比均小于0.5，说明宣肺止嗽合剂原液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较强的抑制性。薄膜过滤法试验显示对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收比均在0.5～2.0的范围内（表2），说明薄膜过滤法可消除供试液的抑菌性，符合药典的要求，可用于需氧菌总数计数的试验。

表2 薄膜过滤法用于需氧菌总数计数的试验结果

在霉菌和酵母菌总数计数的适用性试验中，采用平皿法和1∶10供试液对两种药典的规定菌（白色念珠菌和黑曲霉）进行了试验。各菌的回收比均在0.5～2.0的范围内（表1），符合药典的规定，表明该法可适用。

表1 平皿法用于需氧菌总数计数、霉菌及酵母菌总数计数的试验结果

3.2 控制菌检查方法的适用性

宣肺止嗽合剂属口服类不含药材原粉的中药制剂，依据《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1107[2]，本研究在控制菌检查方法中釆用大肠埃希菌为试验菌种，采用常规法和增加培养基体积法以1∶10供试液进行适用性试验。两种方法对大肠埃希菌阳性对照组均可给出阳性结果，对供试品组及阴性对照组均未检出，见表3。表明供试液对大肠埃希菌无抑菌性，这两种方法均满足《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1106的要求[2]，可用于控制菌的检查。

表3 控制菌检查方法的试验结果

4 讨论

宣肺止嗽合剂是一种液体复方非无菌中药制剂，广泛用于中重度咳嗽和久咳的治疗，且对治疗儿童呼吸道感染安全性高、效果明显[3]，对减轻慢性阻塞性肺疾病患者在急性加重期的炎症反应也有较好疗效[4]，与沙美特罗替卡松联合使用后能有效治疗咳嗽变异性哮喘[5]。由于中成药具有生产工序多、工艺复杂、品质易受原料干扰等特点，在生产、包装、运输、贮存等环节很容易受到外界环境影响而滋生微生物。药品中污染微生物越多，药品变质、失效的风险也就越高，带来的危害也就越严重，可能会造成患者感染，甚至威胁到患者的生命安全[6]。建立与宣肺止嗽合剂匹配的微生物限度检查方法，可确定药品及其原料、辅料等受微生物的污染程度，是评价该药安全性的一项重要指标[7]。

依照《中华人民共和国药典》2020年版四部的规定：在微生物限度检查时，需要判断供试品对试验菌种是否有抗菌活性，如有则要选择合适的方法先消除或中和其抗菌活性再进行检查，以保证方法的适用性[2]。据文献报道，宣肺止嗽合剂处方中的荆芥、陈皮、鱼腥草、薄荷、蜜甘草等成分会在一定程度上抑制粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌等微生物的繁殖和生长[8-11]，药物中添加的苯甲酸钠也可能会导致对某些微生物具有抑菌作用。因此，在方法适用性试验中需要特别关注宣肺止嗽合剂的抑菌作用和对抑菌作用的消除，这也是其他含有抑菌成分药物的微生物限度检查研究中所面临的重点和难点[12-13]。

本研究中，在需氧菌总数计数方法的适用性试验中，以宣肺止嗽合剂原液为供试液，平皿法显示供试液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较强抑制性；采用薄膜过滤法，上述两菌的回收比均处于0.5～2.0，表明薄膜过滤法可消除宣肺止嗽合剂自身的抑菌性，适用于需氧菌总数的计数。在霉菌和酵母菌总数计数检查的方法适用性试验中，平皿法可适用。在控制菌的检查中，使用1∶10供试液、常规法和增加培养基体积法均适用；考虑到常规法使用的培养基数量更少、操作相对简便、费用较低，建议采用本法。

本研究探讨了两种常用的方法（平皿法和薄膜过滤法）在需氧菌总数计数中的适用性，发现薄膜过滤法有良好的适用性。通常薄膜过滤法先采用孔径为0.22 μm的无菌微孔滤膜，对药品过滤阻截微生物和不溶性大颗粒物质，之后把滤膜贴置在培养基表面培养、计数，最终对药品中污染菌种进行检测[14-15]。然而，薄膜过滤法操作繁琐、所用到的测试材料多、对检测人员的操作和环境洁的净度要求很高，易导致假阳性结果，在未来的研究中应继续寻找更加简便、易操作的适用性检测方法。