空肠弯曲杆菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

张风荣，冯之航，王 艳，陈 翔，王 辰，杨新奥，杨金保

（1.山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊 261061；2.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；3.上海海关，上海 200135；4.青岛农业大学，山东青岛 266109）

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni）是一种重要的细菌性肠道病原菌，也是最常见的食源性传染源之一[1]，能够引起人的急性肠炎[2]和Guillain-Barri综合征，还可导致牛和绵羊流产等，对公共卫生安全和畜牧业生产安全具有很大危害。世界卫生组织（WHO）将该病列为最常见的食源性疫病之一。

空肠弯曲杆菌为革兰氏阴性的弯曲短杆菌，微需氧[3]，最适生长温度为37～42 ℃，其抵抗力不强，对干燥、阳光和一般消毒剂敏感[4]。空肠弯曲杆菌可定殖在多种动物肠道内[5]，不引起被感染动物明显症状，但可在其体内长期存在。该菌可随粪便排出，也可通过牛羊乳汁和其他分泌物排出[4]。

空肠弯曲杆菌的确诊需要通过细菌分离鉴定。但该菌属于微需氧菌，培养条件苛刻[6]，在25 ℃不生长，42 ℃生长良好，使得常规分离培养以及生化鉴定耗费较多人力物力，且灵敏度不高[7]。近年来，利用PCR方法检测空肠弯曲杆菌已经取得了长足发展，但由于针对的靶基因和使用的PCR技术不同，建立的检测方法也存在敏感性和特异性差异。本研究拟针对空肠弯曲杆菌的保守区域MapA基因设计特异性引物，建立一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR方法，以期为空肠弯曲杆菌的快速检测和流行病学调查提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

空肠弯曲杆菌菌株，购自ATCC（ATCC 33560）；胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌，均由山东畜牧兽医职业学院实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器

pBLME-T快速克隆试剂盒、氨苄青霉素、LB液体培养基、氨苄青霉素麦康凯琼脂固体基础培养基、感受态细胞（DH5α）、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、rTaqMix、TB Green Premix ExTaqII，均购自Takara公司；胶回收试剂盒，购自天根生物有限公司；哥伦比亚血琼脂固体培养基、布氏肉汤液体培养基，购自杭州微生物试剂有限公司；DNA快速抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；普通PCR仪、荧光定量PCR仪、凝胶电泳仪，均购自赛默飞世尔科技公司。

1.3 引物设计

根据空肠弯曲杆菌（ATCC 33560）在NCBI（GenBank登录号CP012242.1）中的基因序列信息，针对其保守区域MapA基因，利用软件Primer 5.0设计1对扩增引物（mapA-F：5'-CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG-3'；mapA-R：5'-GCTTTATTGCCATTTGTTTTATTA-3'），预计扩增的目的片段大小为589 bp。将设计好的引物送华大基因科技有限公司合成。

1.4 DNA提取

将空肠弯曲杆菌接种于哥伦比亚血琼脂固体培养基，厌氧培养36 h；挑取单个菌落接种于布氏肉汤液体培养基中，厌氧培养24～36 h，12 000 r/min离心收获细菌；使用基因组DNA快速抽提试剂盒提取细菌DNA，将提取的DNA以50 μL TE Buffer溶解，然后置于-20 ℃保存备用。

1.5 质粒标准品构建

以提取的空肠弯曲杆菌DNA为模板，使用引物mapA-F/R进行PCR扩增。PCR反应体系：rTaqMix 1 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板3 μL，最后以ddH2O补足至25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以胶回收试剂盒回收并纯化扩增出的目的片段；将获得的目的片段连接到pBLME-T载体，然后转化至感受态细胞（DH5α）进行克隆；提取质粒，并对阳性重组子进行PCR鉴定；将鉴定正确的阳性重组子（菌液+质粒）送至华大基因科技有限公司测序，并对测序结果比对分析。将构建成功的质粒载体命名为pBLME-T-MapA。

1.6 SYBR Green I荧光定量PCR建立

1.6.1 引物设计与合成 针对构建的pBLME-TMapA质粒，利用Primer 5.0软件设计1对SYBR Green I荧光定量检测特异性引物（fMapA2-F：5'-CTAGAGGAATAGTTGTGCTTGA-3'；fMapA2-R：5'-TGCTTGGTGCGGATTGTA-3'），预计扩增的目的片段为181 bp。将设计的引物送华大基因科技有限公司合成。

1.6.2 标准曲线构建及熔解曲线获得 以pBLME-T-MapA质粒为标准品，测定其浓度。将pBLME-T-MapA质粒进行10倍倍比稀释，以稀释好的质粒作为SYBR Green I荧光定量PCR检测标准品进行扩增。反应体系20 μL：TB Green Premix ExTaqII 10 μL、fMapA2-F 1 μL、fMapA2-R 1 μL、pBLME-T-MapA质粒8 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。根据扩增Ct值构建标准曲线，同时获得熔解曲线。

1.6.3 敏感性试验 将pBLME-T-MapA质粒进行10倍倍比稀释，利用建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法进行检测。将Ct＜35且出现标准“S”形扩增曲线的最低浓度，视为该方法的检测灵敏度。

1.6.4 特异性试验 将空肠弯曲杆菌、胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌5种细菌DNA作为模板，利用建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法进行扩增，验证该方法的特异性。

1.6.5 重复性试验 将pBLME-T-MapA质粒进行10倍倍比稀释，共设置5个稀释度，每个稀释度设置3个重复孔，开展重复性试验。计算重复性试验中Ct值的变异系数（CV），评估检测方法的稳定性。

2 结果

2.1 质粒标准品鉴定

以重组质粒pBLME-T-MapA为模板，使用引物mapA-F/R进行常规PCR检测。结果（图1）显示，PCR扩增产物大小约589 bp，片段大小与预期一致。结果表明重组质粒pBLME-T-MapA构建成功。

图1 重组质粒pBLME-T-MapA扩增结果

2.2 SYBR Green I荧光定量PCR熔解曲线

重组质粒pBLME-T-MapA的SYBR Green I荧光定量PCR扩增结果（图2）显示，扩增产物在78 ℃左右均出现单一波峰，无特异性扩增峰及引物二聚体。结果表明该引物具有良好的特异性。

图2 SYBR Green I荧光定量PCR熔解曲线

2.3 SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线建立

通过Nanodrop核酸蛋白检测仪测定重组质粒pBLME-T-MapA的质量浓度C=251.5 μg/mL。根据拷贝数（copies/μL）=，计算质粒标准品的拷贝数为6.42×1010copies/μL。

以6.42×（108～103）copies/μL的标准质粒为模板，使用建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法扩增检测，获得“S”形扩增曲线（图3）。以读取的Ct值为Y轴，标准质粒浓度为X轴，绘制标准曲线（图4），同时获得SYBR Green I荧光定量PCR的扩增相关系数R²为0.998 1，标准曲线方程为y=-3.366x+33.652。

图3 SYBR Green I荧光定量PCR扩增曲线

图4 SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线

2.4 敏感性试验

以6.42×（108～100）copies/μL的10倍倍比稀释的重组pBLME-T-MapA质粒为模板，使用本试验建立的SYBR Green I荧光定量PCR进行检测。结果（图5）显示，该方法的最低检测浓度为6.42 copies/μL。

图5 SYBR Green I荧光定量PCR敏感性试验结果

2.5 特异性试验

以空肠弯曲杆菌、胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等5种细菌DNA作为模板，使用本试验建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法进行检测。结果（图6）显示，建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法仅对空肠弯曲杆菌有特异性扩增，对其他病原均无扩增。结果表明该方法具有良好的特异性。

图6 SYBR Green I荧光定量PCR特异性试验结果

2.6 重复性试验

以5个稀释度的重组质粒pBLME-T-MapA为模板，分别进行组内和组间重复性试验，各设置3个重复。结果（表1）显示，组内Ct值的CV为0.55%～1.66%，组间为1.07%～2.16%，均小于2.50%，表明该方法具有良好的可重复性。

表1 重复性试验结果

3 讨论

空肠弯曲杆菌为一种人兽共患病病原，是引起人类细菌性腹泻的最重要病原菌之一，可通过食物链传递给人类并引起发病。人感染后的最典型症状是发热及急性胃肠炎等，免疫力极低者会进一步出现心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎、败血症等全身性疾病[8]。因此，建立一种快速而特异的检测方法有助于对该病的预防和控制。目前已建立了多种PCR检测技术，如韩伟等[9]针对16s RNA序列，建立了快速鉴定弯曲杆菌的PCR方法，并将之与自动酶联免疫荧光分析方法结合，使其检测灵敏度可达到25 cfμ/mL；Docherty等[10]建立的磁免疫PCR法，能检测空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和海鸥弯曲杆菌；Guangming等[11]针对弯曲杆菌flaA和hipO基因，首次建立了针对空肠弯曲杆菌的磁捕获-荧光聚合酶快速检测方法。

荧光定量PCR具有快速、灵敏、省时的优势，是鉴定微生物的强大工具，已被广泛应用于临床病原体检测[12-13]。目前，有各种基于荧光的化学方法用于实时荧光定量PCR检测，主要分为四类：水解探针、发夹探针、荧光标记杂交探针和DNA结合染料。虽然基于探针的化学试剂为PCR引物提供了额外的序列特异性，但通常引物设计比较困难且难以优化，因而显著增加了试验总体成本。相比之下，SYBR Green I作为DNA结合染料，与DNA双链结合后发出荧光信号，而未结合的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，保证了荧光信号的增加同步于PCR产物。此外，该染料产生的荧光强度可随DNA浓度变化而相应变化（DNA浓度越高，荧光越强），从而提供了一种灵活的方法，即通过荧光强度检测双链DNA含量，且不需要单独的探针设计和条件优化。该方法检测成本低，操作便捷，易于标准化，可用于高通量检测。本研究针对空肠弯曲杆菌的保守区域MapA基因设计荧光定量PCR特异性引物，建立了基于SYBR Green I荧光染料的空肠弯曲杆菌荧光定量PCR方法，可为空肠弯曲杆菌临床样品的快速检测、流行病学调查以及定量研究提供技术支持。

随后，本研究对建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法进行了敏感性、特异性和重复性验证。敏感性试验结果显示，该方法最低检测浓度为6.42 copies/μL，可达到临床检测要求；特异性试验结果显示，建立的方法仅对空肠弯曲杆菌有特异性扩增，对其他病原均无扩增，表明该方法具有良好的特异性；以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行的组内和组间重复性试验结果显示，组内和组间Ct值CV均小于2.50%，说明该方法具有良好的可重复性。

本研究通过构建空肠弯曲杆菌MapA基因的标准质粒，在优化各反应条件的基础上，基于SYBR Green I染料建立了快速检测空肠弯曲杆菌的荧光定量PCR方法，其检测灵敏度可达6.42 copies/μL，且具有良好的特异性及重复性，可用于进出境试验动物等空肠弯曲杆菌的快速鉴别诊断以及流行病学调查。