辽宁绒山羊毛尾线虫的分子鉴定与遗传进化分析

郑毓秀，于本良，王大为，刘宇明，李 冰，刘孝刚

（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州 121000；2.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164）

毛尾线虫，也称毛首线虫、鞭虫，隶属于毛尾科（Trichuridae）毛尾属（Trichuris），或毛首科（Trichocephalidae）毛首属（Trichocephalus）[1]。毛尾线虫的宿主范围非常广泛，可以寄生在牛、羊、骆驼、长颈鹿、猪、犬等多种动物以及人的盲肠内，对人和动物均有很高的发病率[2-4]。该病目前呈世界性分布，主要在热带和亚热带的发展中国家流行，在我国流行也较为广泛，是一种危害较大的人兽共患寄生虫病，严重威胁着人类健康和畜牧业发展[5-6]。

毛尾线虫的分离鉴定方法主要包括形态学鉴定和分子生物学鉴定。毛尾线虫具有典型的外观形态结构，利用传统的形态学鉴定方法很容易鉴定到属，但是种内鉴定需要对毛尾线虫的虫体大小、交合刺长度、交合刺鞘等微小形态学特征进行鉴定[10]。当遇到一些亲缘关系较近或形态相似性较高的毛尾线虫时，上述的形态学结构特征也将出现一些微小的变化，这给传统的形态学鉴定带来了较大困难[11-12]。

ITS序列是位于18S与28S之间的内转录间隔区，包括核糖体第一内转录间隔区ITS1和核糖体第二内转录间隔区ITS2两段序列[13]。研究[14]发现，核糖体内转录间隔区（ITS）序列在毛尾线虫属的分类学上是比较理想的分子遗传标记。因ITS序列进化速度快，且有高度保守性，受外界环境因素影响较小，所以以ITS为遗传标记进行PCR扩增及序列对比分析的方法，已被广泛应用于到多种寄生虫的鉴定与分类研究工作中[15-17]。

羊是毛尾线虫的重要宿主之一，感染毛尾线虫后可发生盲肠慢性卡他性炎症，严重感染时可导致盲肠黏膜出血性坏死、水肿、溃疡等，引起下痢、贫血、消瘦，生长发育缓慢，甚至死亡[7-8]。辽宁绒山羊是世界上最优秀的绒山羊品种，因其高品质的羊绒质量和稳定的遗传性能被誉为“中华国宝”，是我国政府明令禁止出境的极少数畜禽品种之一[9]。辽宁省东部地区是重要的绒山羊养殖区域，绒山羊饲养业是广大农民脱贫致富的重要产业之一。本研究旨在确定该地区绒山羊毛尾线虫的虫体种类及遗传进化关系，为该病的诊断和防控等研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体样本采集

10株虫体样本均采自于辽宁省东部地区10只辽宁绒山羊的盲肠，依次编号为LN-1～10。根据毛尾线虫的形态结构特征[1]，经过形态学鉴定后，初步确定为毛尾属线虫。将10株虫体样本用生理盐水反复清洗3次，置于-20 ℃保存备用。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit），购自天根生化科技（北京）有限公司产品（货号DP304-02）；DL 2 000 DNA Maker，购自宝日医生物技术有限公司（货号3427A）；2×EsTaqMaster Mix（Dye），购自康为世纪生物科技有限公司（货号CW0682M）；绿色荧光核酸染料（10 000*），购自索莱宝生物科技有限公司（货号G8140）。

1.2.2 主要仪器 YX-280手提式压力蒸汽灭菌器，购自合肥华泰医疗设备有限公司；DYY-12型电泳仪，购自北京市六一仪器厂；Tanon 1600凝胶图像分析，购自上海天能科技有限公司；TC1000-G梯度PCR仪，购自大龙兴创试验仪器北京有限公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅，购自天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 虫体DNA提取

从-20 ℃冰箱中取出单个虫体，放入灭菌的1.5 mL离心管中，加入双蒸水反复吹打冲洗3次后，将虫体放入新的离心管中；加入200 μL磷酸盐缓冲液，用研磨棒充分研磨；加入20 μL蛋白酶K（Proteinase K）混匀后，56 ℃水浴放置1～3 h，直至组织彻底溶解；按照DNA 提取试剂盒使用说明提取虫体DNA，DNA样品于-20 ℃保存。

1.4 引物合成及PCR扩增

根据 GenBank所登录的羊毛尾线虫内转录间隔区ITS1基因序列（登录号AJ310662），设计1对特异性引物——上游引物ITS1-F：5'-GGAGCAACCGTTCAGCCACAGC-3'；下游引物ITS1-R：5'-TCTTCAACGACCTACGAGCCAAG TGAT-3'。

PCR反应体系（20 μL）：模板 DNA 5 μL，上下游引物各1 μL，2×EsTaqMaster Mix 10 μL，ddH2O 3 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，35个循环；74 ℃ 5 min。

将PCR产物分别用2%琼脂糖凝胶进行电泳，用全自动凝胶成像系统观察结果并保存图片，然后进行克隆、测序验证。

1.5 序列同源性与遗传进化分析

将测序所得序列与GeneBank中收录的其他9株毛尾线虫分离株的ITS1序列进行比对分析，并以旋毛虫（Trichinella spiralis）作为外群，通过MEGA 5.05软件校对序列，然后用DNAstar中的MegAlign软件，将样品序列及GenBank中已收录的其他毛尾线虫ITS1序列进行分析，比较其同源性与差异性；利用 MEGA5.05软件，以邻接法（neighbor-joining method）将上述所有序列构建系统发育进化树，分析其遗传进化关系。供比对的其他9株毛尾线虫分离株的ITS1序列信息见表1

表1 9株不同毛尾线虫的ITS1序列信息

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

形态学观察结果显示：虫体外观呈乳白色，前部细长呈毛发状，后部短粗，外形似鞭（图1-A）；雄虫尾部卷曲，雌虫尾部平直，后端钝圆（图1-B）；雄虫尾部有l根交合刺，且有交合刺鞘（图1-C）。10株虫体外观形态和镜下结构均符合毛尾属线虫的形态学特征[1]。

图1 毛尾线虫虫体的形态结构

2.2 ITS1扩增产物琼脂糖电泳分析

分子生物学检测结果（图2）显示：10份绒山羊毛尾线虫样品均成功扩增出约 445 bp的片段，与预期ITS1目的片段长度相符，无非特异性条带，说明成功扩增出目的基因。

图2 辽宁绒山羊毛尾线虫ITS1扩增产物的琼脂糖电泳分析结果

2.3 ITS1序列差异性对比分析

ITS1序列差异性对比分析结果（图3）显示：10株绒山羊毛尾线虫间序列同源性较高，为95.5%～100%。与GenBank中收录的2株中国岩羊毛尾线虫分离株（登录号：MG573308.1和MG573306.1）的同源性分别为95.5%～100%和93.7%～98.7%，与其他7株毛尾线虫分离株（登录号：AM992998.1、AM992997.1、FN543172.1、FN543171.1、HE608854.1、HE608854.1、KX669086.1）同源性为49.4%～76.4%，种内差异（0～2.1%）远小于种间差异（23.6～50.6%）。同源性分析结果说明，本次从辽宁省东部地区辽宁绒山羊体内分离得到的10株虫体均为毛尾线虫。

图3 辽宁绒山羊毛尾线虫ITS1序列差异性对比结果

2.4 分离株系统发育树构建

系统发育树（图4）表明，分离到的10株辽宁绒山羊毛尾线虫高度相似，与GenBank中报道的其他2株中国岩羊毛尾线虫（T.73 DS-2018和T.skrjabini）聚在同一分支，与GenBank中收录的其他动物毛尾线虫分支较远。构建的系统发育树进一步证实，在辽宁省东部地区辽宁绒山羊体内分离得到的虫体是毛尾线虫。

图4 辽宁绒山羊毛尾线虫分离株系统发育树

3 讨论

毛尾属线虫具有典型的形态学特征，所以通过形态学鉴定方法很容易鉴定到属，但对亲缘关系较近的毛尾线虫则很难准确鉴定到种[18]。近年来，寄生虫分子鉴定和分子遗传学分析技术在寄生虫种类鉴定方面取得了很大进展，为寄生虫的种属鉴定提供了新的有效手段，在精准性方面明显优于传统的形态学鉴定方法。核糖体中的内转录间隔区ITS1和ITS2两部分序列具有种内高度保守性，其中ITS1序列可为各种寄生虫的分类鉴定提供可靠的遗传标记，已被广泛应用于线虫种类的分类鉴定[19]。

本研究首先采用传统的形态学鉴定方法，对辽宁省东部山区的10株辽宁绒山羊源线虫进行了鉴定。结果显示：10株虫体外观形态学特征一致，虫体呈乳白色，前部细长呈毛发状，后部短粗，外形似鞭。10株虫体中有6株确认为雌虫，4株确认为雄虫；雌虫外观尾部平直，后端钝圆；雄虫外观尾部卷曲，显微镜下观察具有l根交合刺，并具有交合刺鞘。10株虫体外观形态和镜下结构均符合毛尾属线虫的形态学特征[1]。

在形态学鉴定基础上，本研究以ITS1为遗传标记，采用PCR扩增及序列对比分析方法对10株辽宁绒山羊源线虫进行了分子生物学鉴定。PCR扩增结果显示，虫体ITS1序列长度基本一致，约为445 bp；序列对比分析结果显示，10株虫体与GenBank中登录的2株中国岩羊毛尾线虫同源性最高，分别为95.5%～100%和93.7%～98.7%；系统进化树分析显示，10种虫体与2株中国岩羊毛尾线虫聚集在同一分支上，种内差异（0～2.1%）远小于种间差异（23.6～50.6%）。研究结果说明，本次从辽宁绒山羊体内分离到的线虫为毛尾线虫，同时也证实其核糖体ITS序列种内相对保守，可以作为毛尾线虫的分子鉴定及遗传进化研究的目的基因。