东亚飞蝗DSCAM2多克隆抗体制备

邱 佳，余 瑛

(重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054)

0 引言

唐氏综合征细胞粘附分子(Down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM)是免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族中的成员，具有与Ig相类似的结构特征，其典型的结构域通常以Ig-Fibronectin，FN-Ig-FN模式串联[1-2]而成。最近的研究表明，无脊椎动物的DSCAM在适应性免疫系统中起着与抗体相似的作用[3]。DSCAM可以通过选择性剪接产生多种异构体，与各种病原体特异性结合。理论上，对黑腹果蝇Dscam的N端细胞外结构域Ig2、Ig3、Ig7和跨膜结构域进行选择性剪接，可以产生38 000个异构体[4]。DSCAM异构体已被证实在昆虫免疫保护方面起关键作用，其功能涉及病原体特异性识别、细胞吞噬、免疫信号转导和抗菌肽转录等多个途径[5-6]。在哺乳动物中，DSCAM参与人类神经元的发育和轴突生长[7]。DSCAM缺失可导致脊髓发育失调，引发自闭症、抑郁症和精神分裂症等精神疾病有关[8]。此外， DSCAM表达降低与非小细胞肺癌、结直肠癌以及骨肉瘤等多种肿瘤形成密切相关[9-11]。

人们普遍认为，无脊椎动物缺乏适应性免疫，主要依靠先天免疫(包括物理屏障如几丁质外骨骼、细胞免疫和体液免疫)进行机体防御[12]。DSCAM在无脊椎和脊椎动物广泛存在，且与抗体结构相似，表明它可能与物种进化过程中的抗体演化存在关联。然而，人们对DSCAM选择性编辑的调控机制及其与免疫作用的关系仍然未知。

最近有研究发现，受到真菌感染的东亚飞蝗血淋巴细胞差异表达DSCAM2，提示其可能参与了细胞免疫反应。本研究以东亚飞蝗为材料，从其血细胞中克隆了含有DSCAM保守结构域的DSCAM2828-957抗原片段，经重组表达、纯化和免疫小鼠获得了多克隆抗体并对其特异性和细胞定位进行了检测。此外，还对DSCAM2与影响血淋巴计数的关系进行了初步探索，为下一步进行DSCAM2的选择性剪接机制和免疫相关功能研究奠定了工作基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、QuickCutTMEcoR Ⅰ、QuickCutTMHind III、10×QuickCut Green Buffer 、DNA 连接酶均购自TaKaRa公司，Ultrapure RNA Kit(DNase I)、HiFiScript cDNA Synthesis Kit购自康为世纪公司，质粒提取试剂盒、DNA快速纯化/回收试剂盒购自OMEGA试剂公司，BCA试剂盒购自碧云天公司，其他试剂均为国产分析纯。

蛋白质纯化试剂及配方：细胞裂解液：25 mmol/L磷酸二氢钠 (pH值为8.0)，0.4 mol/L NaCl， 0.1%tween20，0.1 mmol /L苯甲基磺酰氟(PMSF)。包涵体溶解液：25 mmol/L磷酸二氢钠(pH值为7.4)，0.1 mol/L NaCl，9 mol/L尿素，0.1 mmol /L PMSF。平衡溶液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值为8.0)，0.4 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑。50 mmol/L咪唑洗脱液：25 mmol/L 磷酸氢二钠(PH值为7.4)，0.1 mol/L NaCl，18 mol/L尿素，50 mmol/L咪唑。400 mmol/L 咪唑洗脱液：25 mmol/L磷酸氢二钠(pH值为7.4)，0.1 mol/L NaCl，18 mol/L尿素，400 mmol/L咪唑。

1.1.2动物、质粒及菌株

东亚飞蝗由重庆大学基因中心提供。BALB/c小鼠购自重庆医科大学动物中心。质粒pET30a(+)、大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3) 细胞为本实验室保存。

1.1.3DSCAM2序列

该序列数据来源于东亚飞蝗血淋巴转录组测序结果，具体核酸序列在网站NCBI可查询，编号为AJF38204.1。

1.2 方法

1.2.1DSCAM2基因的生物信息学分析

利用NCBI中BLASTp对DSCAM2序列结构分析；采用软件BioEdit进行本地数据库比对出特异性区段；同时分析出抗原表位(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)丰富区段，以此确定PCR扩增区段。

1.2.2引物设计

采用 primer 5.0软件，根据选定的抗原区域设计引物序列分别为F primer：5′-GTTGAATTCATCAGTGTACAAGCTCCCCC-3′; R primer：5′-CAGAAGCTTTCACTTGATTGGAGACTTTCCA-3′。F或R primer分别添加了EcoR I和HindIII识别位点序列。

1.2.3pET30a(+)-DSCAM2828-957重组质粒的构建

东亚飞蝗血淋巴细胞提取总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA第一链，DSCAM2828-957PCR的扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。扩增结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳。

将得到的PCR产物回收纯化，纯化的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用EcoR Ⅰ、Hind III双酶切，再将其进行回收纯化、连接，转化到DH5α感受态细胞。用含卡拉霉素的LB平板筛选转化子。挑选几个菌落PCR鉴定后的阳性克隆进行质粒酶切鉴定及质粒测序。

1.2.4重组DSCAM2828-957表达和纯化

将鉴定为正确序列的质粒，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，37 ℃、250 r/min培养，待OD600至0.6～0.8时，加入浓度为1.0mmol/L IPTG诱导，25℃，250 r/min培养。诱导时间分别为0、6、12、18、24 h。收集不同诱导时间的菌体，进行细胞超声破碎，分离裂解上清及沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

采用表达水平达到峰值的诱导、培养条件，对DSCAM2828-957/ BL21(DE3)进行1L发酵液培养，离心收集菌体，细胞超声破碎后。16 000 r/min离心收集沉淀，并用包涵体溶解液溶解沉淀。用Ni-NTA进行纯化，SDS-PAGE考马斯亮蓝法检测目的蛋白纯度，BCA试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.5DSCAM2多克隆抗体制备和效价测定

将纯化的重组抗原进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后凝胶用1 mol/L氯化钾染色10 min；切下含有目标条带的凝胶块；凝胶块用超纯水洗涤去除氯化钾，经液氮研磨成细粉，用PBS重悬备用。取健康BALB/c雌性小鼠(6～8周)，按每次每只100 μg抗原剂量腹腔注射小鼠，间周免疫，总共免疫3～4次。效价大于5 000时，眼球采血，收集血清，-80 ℃保存。间接ELISA法测定效价。参考文献[13],将抗血清倍比稀释至1∶64 000，所有血清标本均重复3孔，同时设 PBS 作为对照组，读取酶标仪450 nm波长处吸光度值。

1.2.6东亚飞蝗血淋巴特异性检测及细胞定位

1) Western blot法检测特异性。将东亚飞蝗血淋巴细胞总蛋白和纯化后的重组DSCAM2828-957蛋白分别经10% SDS-PAGE分离，转移至用甲醇激活的PVDF膜上，用5%脱脂牛奶的TBST 37 ℃封闭 1 h；以 DSCAM2828-957多抗血清为一抗(1∶1 000 稀释)，37 ℃作用2 h；TBST洗涤3次，加入二抗Anti-Mouse IgG(1∶10 000稀释)，37 ℃作用1 h；TBST洗涤 3次，按ECL显色试剂盒说明书配制显色液，并进行化学发光显示。

2) 瑞氏-吉姆萨染色。制作东亚飞蝗血淋巴细胞涂片，干燥，依次使用瑞氏和吉姆萨染色，观察。

3) 免疫荧光法。制作东亚飞蝗血淋巴细胞涂片，根据文献[14]多聚甲醛固定，打孔，以 DSCAM2828-957多抗血清为一抗(1∶1 000 稀释)，加FITC标记的兔抗鼠二抗，在荧光显微镜下观察拍照。

1.2.7东亚飞蝗总血细胞计数

取羽化一周的东亚飞蝗成虫，每只经腹节注射500 ng siRNA，以GFP siRNA片段为干扰阴性对照，干扰48 h后经血球计数法检测血细胞密度变化。

使用GraphPad Prism 8.0.1 对数据进行统计分析，为确定统计学意义，采用霍尔姆-西达克方法校正多重比较，小于0.05的值被认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 DSCAM2基因的生物信息学分析

经NCBI中BLASTp分析，东亚飞蝗DSCAM2蛋白由2 015个氨基酸残基组成，其中包含了Dscam c、IgI_4_Dscam、IgI_2_Dscam、IgI_1_Dscam、IgI_7_Dscam、IgI_5_Dscam、IgC2_3_Dscam、IgI_6_Dscam、Ig _DSCAM、FN3、I-set、IGc2、Ig_3、IgI_3_Robo、IG_like、IG、PHA03376、PHA02826等18种结构域，主要集中在58～1 990区段。与果蝇DSCAM2异构体X16(NCBI中ID：XP_039148152.1)或人类DSCAM异构体2(NCBI中ID：NP_001258463.1)蛋白结构分析对比(见图1)，都具有I-set、Ig_3和FN3保守结构域，但I-set 和Ig_3拷贝数不同且东亚飞蝗和果蝇比人类的多了一个Dscam_C结构域，这些差异是否影响其功能目前尚不清楚。

图1 东亚飞蝗DSCAM2与果蝇DSCAM2异构体X16或人类DSCAM异构体2结构域比较

2.2 重组pET30a(+)-DSCAM2828-957构建

从东亚飞蝗血细胞中提取总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA 第一链，然后用F primer、R primer对DSCAM2828-957基因片段进行PCR扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示扩增产物大小为414 bp，与设计的片段长度符合，如图2(a)。

A.DSCAM2828-957基因RT-PCR扩增。M:DL2000 DNA marker；1:阴性对照；2-3:DSCAM2828-957PCR产物

将该片段与pET30a(+)质粒进行酶切，再经连接、转化DH5α得到转化子，提取重组转化子质粒进行EcoR I和Hind III双酶切(图2(b))检测，电泳结果显示重组质粒插入片段与扩增片段大小一致，质粒测序结果也显示插入序列与DSCAM2828-957相同，表明pET30a(+)-DSCAM2828-957重组质粒构建成功。

2.3 DSCAM2重组表达及纯化

将pET30a(+)-DSCAM2828-957质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到pET30a(+)-DSCAM2828-957/ BL21(DE3)表达菌株。对此表达菌株进行发酵培养后收集菌体。采用超声裂解法破胞，离心后分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析，结果见图3(a)和图3(b)，表明IPTG诱导培养6～24 h的裂解液上清及沉淀中均有DSCAM2828-957重组蛋白，沉淀中含量更高。这表明DSCAM2828-957重组蛋白在BL21(DE3)中主要以包涵体形式表达，其相对分子质量约21.1 KDa。

将包含体蛋白用尿素溶液溶解，用Ni-NTA亲和层析纯化重组DSCAM2828-957，经SDS-PAGE检测(图3(c))可知，DSCAM2828-957重组蛋白可用50 mM/L 咪唑溶液洗脱，image J软件分析显示该浓度下洗脱得到的DSCAM2828-957纯度为75%，蛋白浓度为1.913 g/L。

M:蛋白质分子量marker；目标条带黑色箭头所示。

2.4 DSCAM2多克隆抗体的效价测定、特异性鉴定及定位

为了制备高纯度DSCAM2828-957以保证免疫后多克隆抗体的特异性，本研究采用切胶免疫法免疫小鼠，获取的多克隆抗体效价测定大于 1∶64 000；采用Western blot检测DSCAM2828-957和东亚飞蝗血淋巴细胞总蛋白均显示出现单一条带(见图4)，表明制备的多克隆抗体具有特异性。

东亚飞蝗具有原血细胞、粒细胞、浆细胞和类卵母细胞4类血淋巴细胞，其中原血细胞和粒细胞较小，瑞氏-吉姆萨染色原血细胞为球形红色，而粒细胞具有多种形态且根据酸碱性质显色[15]。对东亚飞蝗血淋巴细胞进行了瑞氏-吉姆萨染色(见图5(a))和免疫荧光检测(见图5(b))，从细胞形态、大小和染色特征对比分析表明，东亚飞蝗嗜碱性粒细胞高表达DSCAM2。

A.重组DSCAM2828-957蛋白特异性检测。M:蛋白质分子量markerB.东亚飞蝗血淋巴细胞总蛋白特异性检测。M:蛋白质分子量marker

(a)东亚飞蝗血淋巴细胞瑞氏-吉姆萨染色，黑色箭头所示嗜碱性粒细胞(b)免疫荧光分析DSCAM2在东亚飞蝗血淋巴细胞中的定位，白色箭头所示嗜碱性粒细胞。

2.5 敲低DSCAM2表达水平引起东亚飞蝗总血细胞计数增加

用siRNA干扰DSCAM2后，进行东亚飞蝗血淋巴细胞计数，结果发现其血淋巴细胞计数显著增多(见图6)，表明DSCAM2可能参与血细胞增殖调控，详细的机制需要进一步研究。

*，p<0.05，Mean±SEM(n=3)

3 讨论

3.1 DSCAM2抗原片段的选择与多克隆抗体的特异性

本研究对DSCAM2蛋白序列进行特异性、亲水性、抗原性和可及性等生物信息学分析[16]，选取特异性好、抗原表位丰富、大小约400 bp、含有Dscam_C保守结构域片段作为克隆区。采用原核系统成功克隆并成功表达了DSCAM2828-957抗原，经Ni亲和层析纯化目的蛋白免疫小鼠，获取了高效价的多克隆抗体。此方法中选取的抗原DNA片段大小易于在原核系统高水平表达且具有较好的免疫原性，其带有的His-tag，在纯化条件选择时，无需考虑蛋白变性与否，降低了纯化包涵体蛋白难度[17]。同时，利用电泳后切胶[18-19]处理，在较短时间内能获得大量的高纯度抗原蛋白，更容易获得特异性较高的抗体。本实验使用该方法在3次免疫后，DSCAM2828-957多克隆抗血清效价达 1∶64 000，表明该制备方法获得的抗血清高效，能同时识别多个抗原表位且周期短[20]。采用Western blot 检测重组DSCAM2828-957和东亚飞蝗血淋巴细胞总蛋白中的DSCAM2均只有1个条带，表明设计的重组抗原及获得的抗体均具有较好的特异性，可用于后续采用免疫学方法检测DSCAM2表达和研究DSCAM2相关功能[21]。

3.2 DSCAM2异构体与抗原识别

昆虫DSCAM2有多种异构体，如秀丽果蝇(Drosophila elegans)的DSCAM2异构体至少包括76种蛋白(数据来自NCBI Protein 搜索结果)，分子量在73.8～282 KDa范围。本研究制备的抗体检测到东亚飞蝗血细胞DSCAM2分子量仅24.7 KDa。这种小分子DSCAM2，目前报道较少，其功能尚不明确。越来越多的研究证明，DSCAM基因可以由不同的病原体诱发产生不同的亚型，增加免疫细胞吞噬的效率，从而表现出类似适应性免疫的功能[22]，不同亚型DSCAM及其异构体的作用仍有待阐明。本研究发现的DSCAM2异构体主要在血淋巴嗜碱性粒细胞高表达，前期研究已显示嗜碱性粒细胞很可能参与病原真菌吞噬过程[23]，提示DSCAM2的功能可能与嗜碱性粒细胞对真菌的特异性识别和吞噬作用有关。

由于对昆虫DSCAM2在各种组织中异构体的分布情况报道很少，本研究制备的抗体对DSCAM2的特异性检测也只针对东亚飞蝗血淋巴细胞，因此尚不清楚该抗体在东亚飞蝗其他组织特异性如何，也不能确认该方法制备的抗体是否可以用于其他昆虫血淋巴细胞的免疫检测。但本研究提供的抗原设计和抗体制备方法及思路仍能为快速制备高效价、特异性强的目标抗体提供借鉴。

选取抗原表位丰富且特异性强的抗原片段作为重组抗原能较好地保证所制备的多克隆抗体的特异性。本研究制备的抗体对于探索DSCAM2在东亚飞蝗血淋巴细胞中的功能或剪接机制提供了可靠的研究工具。