基于NF-κB 信号通路探讨参麦注射液联合大黄治疗尿毒症心肌病的研究

段学峰，蒋钻红，秦利强，徐光标，崔可

1.浙江省台州医院肾内科，浙江临海 317000；2.浙江省台州医院重症医学科，浙江临海 317000

据统计，我国每天新增约13 万例尿毒症患者[1]。尿毒症心肌病是导致心血管疾病并发症死亡的最主要原因[2]。迄今为止，尿毒症引起心肌损害的发病机制尚未明确。在众多尿毒症毒素中，肠源性毒素对尿毒症患者心血管系统的危害逐渐被研究者证实并重视，其中硫酸对甲酚和硫酸吲哚酚作为肠源性尿毒症毒素的代表引起广泛关注[3-4]。研究显示，硫酸对甲酚和硫酸吲哚酚在尿毒症患者体内蓄积不仅会加速肾脏纤维化，还可使内皮细胞活性氧增多，激活丝裂原激活蛋白激酶/核因子кB（nuclear factorкB，NF-кB）通路，导致炎症反应进而损伤血管内皮细胞，并通过多种机制对患者的心血管系统造成损伤[5-6]。因此，基于NF-кB 通路研究尿毒症心肌细胞的保护机制，可作为尿毒症心肌病治疗的突破点。本研究基于NF-кB 信号通路探讨益气降浊法治疗尿毒症心肌病的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用温州医科大学动物实验中心提供的健康成年SPF 大鼠72 只，体质量（250±20）g，雌雄各半。本研究经浙江省台州医院动物实验伦理委员会讨论审议通过（伦理审批号：TZY-2022042）。

1.2 主要试剂

NF-кB p65 抗体购自美国Santacruz 公司，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒购自美国Sigma 公司。

1.3 药物

参麦注射液（批准文号：国药准字Z33020020，生产单位：正大青春宝药业有限公司，规格：每支装20ml），生大黄煎液：生大黄100g 配制成100ml 煎液。

1.4 实验分组

SPF 大鼠72 只，雌雄各半，随机分成6 组，即正常组、假手术组、模型组、益气组、降浊组和益气降浊组，每组12 只。

1.5 动物模型制备及分组

大鼠在手术前禁水8h、禁食12h。10%水合氯醛腹腔麻醉，取俯卧位并固定。消毒、备皮，在脊柱旁0.5cm 与右肋下1cm 交接位置做一切口，暴露右肾，结扎右肾门肾蒂，切除右肾，之后右肾称重。手术7d 后，按前述手术方式暴露左侧肾脏，分离左肾周围脂肪囊切除肾包膜，分别于肾脏上端和下端楔形切除1/3 左肾组织，重量为右肾重量的2/3。手术切口使用海绵明胶按压止血后缝合，送回单独饲养。假手术组只需完成双侧肾脏周围脂肪囊分离及切除双肾包膜。所有大鼠在手术后连续注射青霉素3d。术后禁食24h，不禁水。使用无创尾动脉血压测量仪测量大鼠尾动脉收缩压。每天均于9:00-16:30测量，共计测量5 次，最后取平均值。

随机选择两组大鼠，分别于手术后2、8、16、24、30、36 周时，收集其24h 尿液。之后使用乙醚麻醉，采集其眼眶血检测血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，Scr），确定大鼠尿毒症模型是否创建成功。造模成功后，降浊组大鼠给予生大黄煎液1ml/100g 灌胃，每天1次，持续1 周；益气降浊组大鼠给予生大黄煎液1ml/100g 灌胃，每天1 次，皮下注射参麦注射液1ml/200g，每天1 次，持续1 周；益气组大鼠皮下注射参麦注射液1ml/200g，每天1 次，持续1 周；模型组大鼠和假手术组大鼠给予1ml/100g 生理盐水灌胃，每天1 次，持续1 周。正常组大鼠不作任何处理。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 大鼠心脏重量指数 完成最后一次治疗后，禁食，不禁水，处死大鼠，称取大鼠心脏重量和左心室重量，计算左心室重量指数（左心室重量/体质量）和心脏重量指数（心脏重量/体质量）。

1.6.2 血标本检测 水合氯醛麻醉大鼠，股静脉采血，酶联免疫吸附测定法检测血清样本中TNF-α、IL-6 水平。具体操作根据试剂盒说明书进行。

1.6.3 心肌组织病理学检测 分离心脏，沿大鼠心尖部纵向对半切开，取一半心肌组织迅速放入10%甲醛溶液中固定，送病理室，剩余心肌组织液氮中保存。将制备好的心肌组织脱蜡水化，分别进行Masson 染色、苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）。

1.6.4 心肌NF-κB p65 蛋白表达检测 采用蛋白质印迹法检测心肌NF-κB p65 蛋白相对表达量，具体操作包括制胶、样品处理、加样与电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、蛋白检测。

1.7 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计软件对数据进行分析处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用独立样本t检验，计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的左心室重量指数与心脏重量指数比较

模型组大鼠的左心室重量指数和心脏重量指数均显著高于正常组（P<0.05）。益气降浊组大鼠的左心室重量指数和心脏重量指数均显著低于模型组、益气组、降浊组、假手术组（P<0.05），见表1。

表1 各组大鼠的左心室重量指数与心脏重量指数比较（±s）

表1 各组大鼠的左心室重量指数与心脏重量指数比较（±s）

注：与益气降浊组比较，*P<0.05；与正常组比较，#P<0.05

2.2 各组大鼠的心肌组织HE 染色

正常组大鼠心肌组织分布均匀，细胞排列整齐，肌纤维走行相同，可见少量成纤维细胞；模型组大鼠心肌排列欠规则，呈波浪、松散状，细胞形态模糊，成纤维细胞明显增加，合并炎症细胞浸润；假手术组与模型组较为相似；益气组、降浊组、益气降浊组心肌组织均有显著变化，益气降浊组大鼠心肌纤维走行相同，且心肌组织分布均匀性、细胞排列整齐度均优于益气组和降浊组，见图1。

图1 各组大鼠心肌组织（HE 染色，×200）

2.3 各组大鼠的心肌组织Masson 染色

大鼠胶原纤维为蓝色、肌纤维为红色。正常组大鼠心肌纤维整齐，少量胶原纤维均匀分布于心肌间质；模型组大鼠心肌胶原纤维明显增多，排列紊乱，有心肌纤维化表现；假手术组大鼠心肌胶原纤维稍有变化，心肌胶原沉积轻微减少，排列不均匀；益气组、降浊组、益气降浊组大鼠心肌胶原沉积均明显减少，心肌纤维整齐，益气降浊组变化最为明显，见图2。

图2 各组大鼠心肌组织（Masson 染色，×200）

2.4 各组大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表达水平比较

模型组大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表达水平均显著高于正常组（P<0.05）；益气降浊组大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表达水平低于模型组、益气组、降浊组、假手术组（P<0.05），见表2。

表2 各组大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠的TNF-α、IL-6 及NF-κB p65 蛋白表达水平比较（±s）

注：与益气降浊组比较，*P<0.05；与正常组比较，#P<0.05

3 讨论

尿毒症是各种肾脏疾病发展的终末阶段，可増加心血管疾病的发生率和病死率[7]。尿毒症患者临床表现为胸闷、胸痛、心悸、呼吸困难等，多伴有心肌肥厚、心脏扩大、心输出量减少，重者出现充血性心力衰竭、猝死[8-9]。心肌病在中医属真心痛、心悸、胸痹等范畴；尿毒症在中医属肾风、虚劳、水肿、癃闭、关格范畴，是毒、热、瘀、湿、饮共同作用的结果。参麦注射液联合大黄是治疗尿毒症心肌病的有效手段之一。参麦注射液主要成分为麦冬、红参，具有养阴生津、益气固脱之功效，可用于治疗气阴两虚的疾病，如肺心病、病毒性心肌炎、冠心病等。红参可增强心肌对缺氧的耐受力，对心肌细胞DNA 合成有促进作用。同时还可调节心肌组织血流量，有效保护受损的心肌超微结构。人参皂苷是红参的有效成分之一，可抑制血栓烷A2，进而扩张血管，减少心脏负荷，缓解心肌缺血。麦冬具有稳定心肌细胞膜、正性肌力作用。参麦注射液可抑制平滑肌细胞膜Na+-K+-ATP 酶活性，对Na+-Ca2+与Na+-K+转换产生影响，增加内流的Ca2+，以提升心肌收缩功能，降低周围血管阻力、减少心肌耗氧，调节心肌能量代谢，增加缺血心肌能源储备，清除氧自由基，有效保护心肌。临床研究显示，参麦注射液治疗严重心功能不全患者能够改善心功能，提高心肌收缩力，有直接正性肌力作用[10]。参麦注射液可下调Bax 蛋白表达，减少心肌细胞凋亡，对心肌细胞起保护作用[11]。除注重心肌细胞的保护外，也要重视患者毒素的排泄，其中生大黄具有清热解毒、通里攻下、活血化瘀的作用。可有效清除胃肠内细菌、毒素，活血化瘀，调节微循环，加速新陈代谢[12]。大黄性寒、味苦，具有清热解毒、凉血泻火、逐瘀通经的功效。现代药理学研究显示，大黄可在一定程度上改善与保护血液流变学、凝血功能，具有抗心律失常、强心、抗心肌缺血、抗血管痉挛、保护心肌、抗动脉粥样硬化、降血压、清除氧自由基等多重功效。大黄酸是大黄的成分之一，研究显示大黄酸可改善过氧化氢诱导的心肌细胞损伤。多项临床研究显示大黄提取物大黄素用于急性心肌梗死患者，可保护心功能，减少梗死面积，还可在一定程度上抑制炎症反应[13-14]。研究发现，参麦注射液联合大黄可显著降低左心室重量指数与心脏重量指数，对心脏结构变化有改善作用[15]。

研究发现TNF-α、IL-6 能激活丝裂原激活蛋白激酶信号通路并诱导其下游转录因子蛋白家族活化，进而诱发心肌肥厚、促进胶原合成，最终损伤心肌[16]。近年来研究证实，在感染、创伤、毒素等因素的剌激下，活化的细胞因子扮演信使的作用，激活心肌细胞的抑制物质，最终导致心脏功能受损[17]。本研究结果提示尿毒症心肌病模型大鼠炎症反应明显，TNF-α、IL-6 水平升高，而益气降浊法能明显缓解炎症反应，进而避免过度激活TNF-α、IL-6。研究证实，炎症细胞因子与NF-кB 调控作用密切相关。调控NF-кB 的重要蛋白之一为IκB-α。药理学研究发现，尿毒症心肌病能够扰乱细胞调节能力，并影响信号通路系统，器官细胞的NF-кB 下调与机体的炎症反应强度减弱有关[18]。应用参麦注射液后，IκB-α 表达上调，减少TNF-α 的生成与释放，说明对NF-кB 信号传导路径进行调节能抑制炎症反应，进而保护机体细胞。本研究HE 染色、Masson 染色结果提示，模型大鼠心肌组织炎症细胞浸润、间质纤维化、细胞坏死，益气降浊法可减轻心肌损伤、改善心肌纤维化。

综上所述，尿毒症可通过NF-кB 信号通路过度激活而诱发心肌损伤，参麦注射液联合大黄能抑制该信号通路过度激活，缓解炎症反应，保护心肌细胞，预防尿毒症心肌病。