乳制品常见食源性致病菌检测技术研究进展分析

文 刘艳丽 郭培培 张方方 河南花花牛乳工程研究院有限责任公司

乳制品是以鲜羊乳或牛乳为主要原料制成的各种食品。因其良好的口感与丰富的营养，在市场中拥有大量的受众。但同时，也容易受到食源性致病菌的污染，进而诱发一些食品安全问题。所以，做好乳制品食源性致病菌的检测，已成为保证乳制品相关食品安全的关键。鉴于此，文章综述了检测乳制品食源性致病菌的几种常见技术。

得益于我国社会经济的稳健、快速发展，进一步提高了民众的物质生活水平，由此也明显改善了民众的膳食结构，更多人加大了对乳与乳制品的购买量。据有关统计数据显示，在1996年-2006年，城镇居民家庭鲜奶人均购买量增长数倍，由4.6kg增长到18.3kg，虽然从2007年开始购买量有所下滑，但购买量依旧较高。而与之相对的则是，乳和乳制品质量安全事件愈加频发，使得人们越来越关注乳制品的安全问题。

乳制品拥有丰富的营养，能够提供人体所需的维生素B2、维生素A、磷、钙及蛋白质等。伴随近些年人们生活质量的提升，普遍改善了国内家庭的膳食层次，由此也增大了对乳制品的需求。当前乳制品的种类主要有粉态乳、液态乳及其他种类的乳制品。正因乳制品含有丰富的营养，因此其受微生物污染的几率较大。据相关调查显示，诱发乳制品安全事件的关键因素，便是致病菌污染所导致的中毒。乳制品食源性致病菌种类较多，譬如沙门氏菌等，这些致病菌在自然界广泛存在，能够通过多种途径给产品造成污染，导致产品变质，如加工人员、运输过程等。尤其是奶粉中存在的食源性致病菌，容易给婴幼儿造成感染，且有着较高的致死率。鉴于此，应用科学、正确的检测方法至关重要。

1.基于培养的检测技术

现如今，对于乳制品检验，国家明确了相关标准，如GB4789.40-2010《阪崎肠杆菌检验》，GB4789.10-2016《金黄色葡萄球菌检验》等。通常而言，同种微生物在相同培养时间、温度与培养基下，菌落特征相对稳定，如菌落的形状与颜色等，所以，通过对菌落形态特征地观察，能够有效判断微生物的种类。通过基于细菌培养的检测方式，均能从样品内获得致病菌定量与定性的检验结果，拥有准确度高、成本低等优点。但要经过样品生化鉴定、分离、增菌、样品处理等过程，暴露出操作复杂、周期长及能够鉴定的微生物种类较少等缺陷，无法对市场需求做良好满足。故此，一些拥有更佳特异性、能更快完成检测的致病菌检测技术陆续出现。

2.分子生物学检测技术

分子生物学发展时间较久，近十多年来在食源性致病菌检测方面，得到最广泛应用的分子生物学技术，便是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。同时，基于常规PCR技术，又衍生出环介导等温扩增技术、多重PCR等技术。

2.1 常规PCR技术

PCR拥有和DNA天然复制过程相似的原理，其特异性主要是依赖与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过对DNA双链进行加热促使其变性为单链DNA，然后将单链DNA作为模板，融入与模板DNA两端正领近序列互补、2段人工合成的寡核苷酸片断为引物，也就是下游与上游引物，此引物结合互补模板单链DNA碱基后，在DNA聚合酶、4种脱氧核糖苷酸存在的前提下，引物沿模板DNA链，朝5’→3’方向延伸，自动合成新的一条DNA链，合成的新DNA双链，又能作为下次循环模板。能够较快完成一个循环，通常为2-4min，目的基因经2-3h就可实现数百万倍的扩增。例如沙门氏菌检测技术的发展，Rahn等借助沙门氏菌的invA完成了一对引物的设计，对沙门氏菌首次借助PCR方法完成检测，检测结果显示检出沙门氏菌630株，检出血清型上百种、非沙门氏菌142株、21个菌属，达到了99.4%的检出率。

2.2 环介导等温扩增技术

该技术诞生于2000年，由Notomi开发所得，属于新型的一种核酸扩增技术（LAMP）。其结合目的基因6个区域，完成4条引物地设计，于等温条件下（60-65℃）经过DNA聚合酶的置换，实现了扩增目的基因的高效、快速扩增。袁耀武等，关于单核细胞增生李斯特式菌的检测，便借助LAMP技术。实际操作中选FTA滤膜提取的细菌DNA为模板做扩增，完成了12株菌的检测，检测结果显示具有7.3×101CFU/mL的灵敏度，无交叉反应，此方法特异性好、灵敏度高，且对于仪器无较高要求，尤其适用于经济不发达地区或基层。

2.3 多重PCR技术

该技术是在同一反应体系加入2对及以上特异性引物，完成多个目的片段的扩增。其原理为在特异性引物、适当缓冲液、模板DNA及dNTP存在的情况下，借助DNA聚合酶催化，扩增多对特异性引物结合的DNA片段。因为在相同反应体系内，多重PCR能完成多个基因的检测，有助于检测成本及时间的节约，属于经济性良好、效率高的食源性致病菌检测技术。有学者结合sdfl、spy、Hat、invA等沙门氏菌特异性基因建立了多重PCR方法，检测不同血清型沙门氏菌，最终得出，全部沙门氏菌均完成对应目的片段的特异性扩增，检测生肉中沙门氏菌时通过磁分离富集处理，灵敏度降至102CFU/g，使检测时间与成本得以有效节约，保证了检测效率。

2.4 核酸交联染料结合PCR技术

关于乳制品致病菌的检测，PCR技术存在一定缺陷，如无法完成死菌与活菌的有效区分，若依旧把提取的死菌DNA作为模板展开特异性扩增，可能会有假阳性的结果出现。为了良好检测乳制品的食源性致病菌，保证食品安全和民众身体健康，需要探索更具准确性且检测更为迅速的活菌检测技术。核酸交联染料便是采用烷基化试剂，且试剂≥2个烷基化官能基团，含有苯醌吖啶、叠氮溴化丙锭（PMA）等，是能选择性透过死菌的一类细胞膜，通过与DNA共价交联，把死菌DNA扩增信号物质消除，借助PMA/EMA -PCR技术，可以避免死菌影响到PCR扩增，保证扩增信号仅源自活菌DNA，从而得到与国际方法一致的检测结果。现如今，检测致病菌时较常应用PMA和EMA。

有学者在检测婴幼儿食品内的蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌及阪崎肠杆菌的时候，处理样品时应用PMA，其能将死菌细胞膜透过结合、交联DNA，形成共价碳氮键，能够带给死菌DNA于PCR时扩增有效抑制，使检测更为精准，避免了由于死菌存在，所导致的假阳性结果。在富集培养12h后，能得到100CFU/g的检测灵敏度。Wang等在检测活的大肠杆菌O157:H7时，将PMA和PCR技术相结合，死菌影响被消除之后，于牛奶样本内上午检测限为5×103CFU/mL；关于发酵乳制品内副干酪乳杆菌活菌的检测，采用了PMA-qPCR的方法，使死菌影响被消除。

2.5 实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术（real-time quantitati ve PCR）诞生于1992年，是由日本人Higuchi所提出，而该技术正式进入市场，则是1996年美国Applied Biosystems公司，其所推出的实时荧光定量PCR仪，使PCR技术真正迈向定量。该技术所具有的最明显优势便是将荧光基团加入整体体系，通过积累荧光信号，实现对PCR整个过程的实时检测，不用内标物，每轮循环均会对荧光信号强度展开检测。同时，录入电脑软件，将各样品的Ct值计算出来，结合标准曲线，获得定量结果。事实上，该技术属于闭管检测方式，扩增之后不用展开电泳，自动化水平更高，降低了污染程度，使检测特异性与灵敏度更高。有学者在检测大肠杆菌O157:H7的时候，为了取得更高的特异性，尝试把两种技术相结合，即荧光定量PCR技术+磁珠分离技术，取得了100%的特异性，非O157抗原大肠杆菌无交叉反应出现。开展牛奶样品模拟检测时，直接用磁珠从样品内获取大肠杆菌O157，使样品富集步骤略去，PCR受抑制剂影响也得以减少，从而检测更为快速，达到102CFU/mL的灵敏度。

2.6 重组酶等温核酸扩增技术

作为体外恒温核酸扩增的新技术之一，此技术通过对T4噬菌体中核酸复制机制进行模仿，然后借助重组酶UvsX和Gp32单链结合蛋白，于体外恒温环境下结合与识别DNA模板特异性，并且借助链置换DNA聚合酶Bsu，有效扩增模板DNA。这一项技术具有诸多优势：有很高的灵敏度、便捷的操作、时间短等，但缺陷也较为明显，即对于某些特定短序列核酸束手无策。现如今，针对食源性致病菌或食源性病毒等检测方面，该技术应用较为广泛。高建欣等学者，通过将RPA与乳胶微球试纸条（Latex Micro -sphere Test Strips,LMTS）良好结合，再依托金黄色葡萄球菌的基因nuc保守区序列，设计出特异性引物，通过RPA扩增，使金黄色葡萄球菌的检测更为快速，能够达到1.2×102CFU/mL的灵敏度。刘立兵等人，建立了志贺氏菌实时荧光重组酶聚合酶扩增检测技术，具体是根据志贺氏菌侵袭性质的粒抗原H基因（ipaH）保守区序列的设计与exo探针。此方法完成了志贺氏菌的特异性扩增，提高了检测速度，当处于39℃恒温时通常20min，能达到3.5×10-3ng/uL的灵敏度，并且在检测人工污染样本时，采用此方法，只用7-12min就能完成检测。GAO等人，则提出一种能实现沙门氏菌快速检测的RPA-LFD方法建立，在温度为30-45℃时，很快就能达到相关扩增子检测阀值，一般在8min左右，在特异性与灵敏度方面优势明显。与此同时，检测食源性致病菌时依托RPA技术，能获得较为便捷的一类方案。

3.免疫学检测技术

研究者Berson与yalow在1959年完成了现代发射免疫测定法地创建，主要做法是把免疫反应与发射性同位素示踪法有机结合，进而揭开了免疫分析领域发展的序幕。发展至今，免疫学技术的特异性强、灵敏度高及简便等特点，已得到学界的高度认可，多应用于微生物的相关检测。原理如下，相应抗体和体内外抗原相遇，都能实现各种抗原抗体反应，如沉淀反应、中和反应等。因为特定抗体（抗原）反应强度和量具有密切关系（函数关系），能够借此对样品展开定量与定性分析，ELFIA与ELISA等为主要技术。

3.1 ELFIA

Enzyme-Linked Fluorescent Immunoassay，ELFIA即酶联荧光免疫分析技术。该技术融合了基于酶联免疫吸附技术发展创建的用酶系统和荧光免疫分析，诞生的一种快速检测微生物的方法。它有效提升了分析灵敏度，是依托理想荧光底物，替代掉显色底物，进而在有效扩大测量范围的同时，避免了试剂的大量使用。刘新亮等学者，采用下述几个步骤，快速检测了沙门氏菌：首选，采用全自动荧光酶免疫分析仪（mini VIDAS）完成初筛，随后用沙门氏菌显色培养基完成复筛，最后在全自动微生物检定仪（VITEK 2Compact）作用下，完成阳性菌株生化性状鉴定。初筛通过此种联用法，简短时间内就能完成阳性菌株的精准鉴定，通常时间约为45min，沙门氏菌显色培养基分离纯化阳性菌株之后，结合血清学凝集试验结果和VITEK检测结果就能对其是否为沙门氏菌进行判断。运用这一方法检测395种水产品与食品中的目标菌，所得结果和国际法完全相同，具有良好的准确性，同时拥有自动化程度高、高效快捷等显著优点。

3.2 ELISA

酶联免疫吸附技术，（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）。这项技术的基本原理是，在可溶性抗原（抗体）在某个固定载体表面吸附后，添加酶标抗原（抗体），进而产生抗原和抗体反应及相应复合物，通过洗涤之后，冲洗掉游离的酶标抗原与抗体，再进行酶底物的添加，结合载体上抗原抗体复合物，实现免疫酶染色，对有色产物量进行定量或定性分析，就能得到样品内待测物质的含量。邵敏等完成了阪崎肠杆菌特异性抗体相关间接ELISA检测法，结果显示37℃显色时间10min，能达到102CFU/mL灵敏度，此方法的显著特点为效率高，具有很强特异性，并为食品内阪崎肠杆菌的检测提供了方向。胡金强等用金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因为靶标，通过生物素标记探针结合地高标记引物扩增PCR的产物杂交，然后杂交ELISA平板上链霉素，最后抗地高辛抗体显色建立了PCR-ELISA检测技术，结果显示，通过PCR-ELISA技术检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，具有101CFU/mL的灵敏度与普通PCR检测敏感性（103CFU/mL）相比较，要高100倍，实验全程仅需5-6h。此研究所建立PCR-ELISA方法，可以对牛奶的金黄色葡萄球菌进行准确、敏感及特异地检测。

结语

在检测乳制品时，通过生化鉴定等传统国际检测方法，不能检测难培养的致病菌，暴露出特异性不佳、耗时等缺陷，难以做到有效及时的检测。伴随分子生物学及免疫学的日益发展，在国内外乳制品快速检测中PCR技术、免疫学技术及衍生的技术已然得到广泛应用。然而PCR也存在较为明显的缺陷，即易产生假阳性、假阴性。与传统检测相比，ELISA技术拥有能完成大量样本同时检测、操作便捷、准确、快速等特点，但这一技术存在较多的影响因素，其准确度和灵敏度受抗体影响较大，并且结构类似物也可形成程度不一的交叉反应，在未来应用中还应进一步探索操作规程标准化、灵敏度提升、减少各因素影响等方面。不难预见，在科技日益发展的推动下，乳制品中致病菌的检测及时性、便捷性、准确性、特异性及灵敏度等方面，都将获得持续改善及发展。