蝴蝶兰组织培养技术要点分析

张 婷

(广东省惠州市农业科学研究所，广东 惠州 516000)

本文研究了蝴蝶兰组织培养的相关技术，通过实验论证了在散射光环境下幼叶诱导蝴蝶兰原球茎能够达到最佳效果。最佳培养基为MS+6-BA6毫克/升水解乳蛋白500毫克/升+蔗糖5克/升（pH=5.4）；最适增殖培养基为MA+6-BA2毫克/升+NAA1毫克/升+水解乳蛋白500毫克/升+蔗糖25克/升+琼脂5克/升（pH=5.4）；最适生根长苗培养基为1/2MS+IBA1.5毫克/升+NAA0.05毫克/升+0.3%活性炭+蔗糖25克/升+琼脂5克/升（pH=5.4）。

1 蝴蝶兰组织培养技术的注意事项

1.1 培养基添加物对蝴蝶兰增值与分化的影响

一般可以在蝴蝶兰组织培养中添加适量天然物质，能够供给蝴蝶兰幼苗微量营养成分、生长激素等，像是在其中加入120毫克/升香蕉泥，就能够对原有pH值进行缓冲，以此达到壮苗与生根作用。相关资料指出，在培养基中加入适量椰乳或香蕉泥，能够促进原球茎的增值。在蝴蝶兰丛生芽中加入一定的添加物，能够促进和诱导幼苗生根。而在其内加入高浓度活性炭，能够促进原球茎增值。

1.2 原球茎继代中褐化的防治

蝴蝶兰与其他兰科植物类似，原球茎状体在继代培养过程中易褐变死亡，很难增值。通过将1克/升活性炭加入到培养基中，并在合适时间内将原球茎褐化的部分进行切除，并重新配置新鲜的培养基，防治外植体出现褐变死亡，将10%椰子水加入培养基中，能够让原球茎更快生长，在其增值环节中有效抑制褐变现象。

2 蝴蝶兰组织培养技术分析

2.1 实验材料

大红品系的3～4月龄蝴蝶兰幼苗。

2.2 试验方法

第一，清洗消毒外植体。取蝴蝶兰植株幼叶（生长龄分别为2周、4周）与气生根尖，用自来水清洗。在试验工作台绝对干净的环境下，将叶与根尖置入无菌瓶中，用75%酒精消毒半分钟，之后利用无菌水重复清洗3次，再将其浸泡在0.1%升汞溶液中，持续10分钟，再用无菌水重复冲洗4次，结束后放置待用。第二，原球茎的诱导。将幼叶切块，每块规格4毫米×4毫米，长根尖规格为8毫米，使用极性接种方式，培养基选择MS，加入NAA1毫克/升激素与不同浓度BA（1毫克/升、2毫克/升、4毫克/升L、6毫克/升）配比的诱导培养基，所要比较的光照环境为散射光与2000勒克斯两种，每瓶要完成一个接种工作，处理10瓶后，重复操作3次。2个月后对不同外植体在不同培养基中原球茎的诱导率与生长状态进行观察总结。第三，原球茎增殖。在MS培养基中以5个为单位将原球茎接种到其中，并在其内加入NAA1毫克/升激素与不同浓度BA（1毫克/升、2毫克/升、4毫克/升、6毫克/升）配比的增殖培养基。2个月后，对原球茎所得到的增殖倍数以及原球茎大小进行统计。在上述培养基中加入500毫克/升水解乳蛋白，5克/升琼脂以及25克/升蔗糖，pH值5.4，培养条件均为26℃，光照时间18小时，光照强度2000勒克斯。

2.3 壮苗与生根

将培养基所产生的蝴蝶兰小苗转接到各生根培养基中，每瓶3株，待10瓶完成后，上述流程重复3次，在30天后对苗生根率以及生长状态、平均生根率进行统计。在生根培养基中加入0.3%的活性炭+蔗糖25克/升+琼脂5克/升，培养条件均26℃，光照时间18小时，光照强度2000勒克斯。

3 结果与分析

3.1 不同外植体诱导原球茎的差异

以蝴蝶兰根尖、幼叶（分别为2周、1个月）的叶来展开诱导原球茎的实验。诱导率最高为38%，褐变率最低为6%。成熟叶难以产生较高的诱导率，且褐化严重到39%。蝴蝶兰根尖未诱导出原球茎。从结果上看，幼叶生长龄在2周的更容易产生原球茎。而就相同叶片来说，叶基部较叶中和叶尖的切块能产生更高的诱导率。幼叶如果尺寸较小，即使不切割也能够达到原球茎诱导的目的。

3.2 不同浓度的BA对原球茎诱导的影响

以大小在2厘米左右、生长龄在一周、色泽嫩绿的叶片做诱导材料。在做好灭菌处理后将其中的原球茎接种到不同浓度的BA培养基中。在培养到15～20天发现叶片被切割周围产生鲜绿色的原球茎状小突起，和快发育成原球茎。

从表1看，BA培养液在不同浓度的情况下会对原球茎诱导率与大小造成较为明显的影响。随着2毫克/升的BA浓度上升到6毫克/升的BA浓度，最高诱导率为37.33%，高浓度BA对原球茎的诱导有着促进作用。但原球茎直径会随着浓度的增大呈现由小到大再由大到小的趋势。BA6毫克/升时存在最大原球茎直径3.5毫米，BA10毫克/升时存在最小原球茎直径1.6毫米。

表1 不同浓度6-BA对原球茎诱导的影响

4 不同光照条件对原球茎诱导的影响

在诱导原球茎的操作阶段，外植体容易产生褐化现象，为能做好褐化问题的防治工作，需要频繁更换培养基，通常每10天更换一次，在培养基更换过程要避免叶片被放置过长实践，以此降低褐化程度。在培养过程中，可发现光照强弱也会影响到褐化程度，当达到2000勒克斯的光照前度后，会产生很严重的褐化现象，褐化程度将达到40%；如果光照是由其他培养架反射的弱散射光而形成，将能够较好的抑制褐化现象，褐化程度只有10%。

5 不同浓度BA对原球茎增殖与诱导出苗的影响

将所诱导的原球茎接种到增殖培养基中来实行增殖培养。通过表2可以看出，BA在不同浓度时对原球茎大小存在较为明显的影响。浓度增加，原球茎增殖配属也将增加，而原球茎大小成先升后降趋势。当BA浓度为6毫克/升时，能够达到最高原球茎增殖倍数6.8，原球茎最小为1.7。而在增殖的过程中还会生成许多丛生芽。如果BA浓度降低，当其为2毫克/升，原球茎将减小增殖倍数。

表2 不同浓度6-BA对原球茎增殖和生长的影响

但生成的原球茎多而粗壮，因而最佳BA浓度为2毫克/升。

6 原球茎的生根壮苗

在小苗增殖后将其接种到生根壮苗培养基中，可以得到结果，基本培养基为1/2MA，NAA为0.05毫克/升，IBA为1.5毫克/升时，苗的生根率达到最高500%，且苗的生长势最健壮。

7 结束语

通过实验可以发现，光照条件、外植体个数、BA浓度的不同，都会对原球茎的诱导产生影响，叶基部的切块较叶中和叶尖的诱导率更高，通过切割叶片时，如果切口过多，会导致叶片加快褐化死亡。因此在切割叶片的过程中，应从叶基部进行切割，以此提高诱导率。在实验中可以发现，BA浓度增加，能够提高原球茎增殖率，同时即使不加BA，原球茎也能实现增殖，大概率是因为原球茎体内以存在一定的细胞分裂素。在生根壮苗培养环节，2/1MS能够产生更好的效果。