甲基化与组蛋白修饰在股骨头坏死中的机制及中医药干预进展

高宇鹤 徐西林 李志刚 赫龙 薛玉满 张晓峰*

1.黑龙江中医药大学研究生院,黑龙江 哈尔滨150040 2.黑龙江中医药大学附属第二医院,黑龙江 哈尔滨150001

股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是指由于各种病因诱发骨细胞坏死的一种常见疾病,病理过程为“病因导致骨缺血,进而细胞坏死,成骨细胞分化使骨修复,然而持续病因作用导致骨吸收大于骨生成,因此外力致使股骨头塌陷”[1]。ONFH的发病机制尚不完全清楚,使其成为骨科难治疾病之一。存在很多学说来解释ONFH的发病机制,例如骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化异常、脂代谢异常、骨质疏松及骨细胞凋亡学说等[2]。中国年增加5万～10万例SONFH患者,且该数字呈上升趋势[3]。高发病率、高致残率迫使人们急需寻找有效的治疗方法。众多研究证实,表观遗传修饰在调节骨坏死、凋亡和骨髓间充质干细胞分化方面起着重要作用,因此可能是潜在治疗靶点。

表观遗传学在中医药领域的研究中,在2010年以前,年发文量不足5篇,之后逐年增多,2016-2018年,为发文量的高峰期[4]。中医药治疗股骨头坏死的疗效明显、创伤小,早期可减轻患者痛苦。因此,本文通过综述表观遗传学中DNA、RNA甲基化、组蛋白在防治股骨头坏死中的作用机制,以期为中医药防治ONFH提供足够的理论。

1 DNA 甲基化与股骨头坏死

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的催化下,腺嘌呤或胞嘧啶通过共价结合S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基团,形成5-甲基胞嘧啶(5 mC)的过程[5-6]。在激素性ONFH中,激素可以诱导BMSCs中ABCB1基因过甲基化修饰,使P糖蛋白合成减少,然而降低其甲基化能恢复细胞功能[7]。地塞米松通过DNA甲基化调控BMSCs分化[8]。另外在酒精性ONFH中,114个位点中23个位点显示高甲基化,并在OPG/RANKL/RANK基因中发现多个CpG位点处于异常甲基化状态[9]。ONFH组BMSCs增殖能力降低与FZD1 基因的异常CpG岛高甲基化相关[10]。王鹏等[8]在中晚期时使用地塞米松干预BMSCs后,发现DNA甲基转移酶1与H3K27 me3增加、H3K4me3减少有关。

10-11易位蛋白(ten-eleven-translocation protein,TET)酶家族在DNA去甲基化过程中起到关键调控功能,促使DNA主动去甲基,5 mC在TET酶的不断氧化下,依次形成5hmC、5fC、5caC产物[11-12]。另外5hmC在激素性ONFH组上调,并且TET3通过影响5hmC水平,进而改变骨细胞凋亡[13]。研究认为激素性ONFH是一种多基因病,3个关联基因NR3C1、MTHFR和IGFBP3与DNA甲基化存在交互作用[14]。

2 组蛋白修饰与股骨头坏死发病机制

与DNA结合形成核小体的组蛋白是构成染色质的结构蛋白,通常经过乙酰化、甲基化、磷酸化、腺苷酸化等对组蛋白进行修饰[15]。

2.1 组蛋白去乙酰化修饰与股骨头坏死

组蛋白去乙酰化由去乙酰化酶(HDACs)催化,促进核小体及其周围DNA的相互结合,继而使基因转录发生沉默。哺乳动物中包含4类HDACs,其中Ⅰ类为HDAC1、2、3和8;Ⅱ类包括HDAC4、5、6、7、9和10;第Ⅲ类又称沉默信息调节因子2相关酶类(Sir2-related enzymes,Sirtuins);Ⅳ类HDACs主要是HDAC11。其中Sirtuins家族包括SIRT1～7,均以一个辅助因子NAD+为结合域与核心催化结构域相构成[16]。

研究发现SIRT3在激素处理的BMSCs中降低[17],用花青素和白藜芦醇处理成骨细胞时通过增加 SIRT1与SIRT3减少细胞凋亡[18]。SIRT6通过促进成骨分化从而预防股骨头坏死[19]。过表达SIRT6的小鼠在缺血性手术后抵抗骨细胞死亡,而SIRT6敲除表现出加重的骨质流失和严重的畸形。另外在股骨远端骨骺发生缺血性损伤后,SIRT6靶向维生素D受体(VDR)-RANKL通路对预防ONFH至关重要[20]。用SIRT6治疗的髓系细胞中,骨缺血坏死手术中诱导的炎症反应可能会减少[21]。

C/EBPα与成脂有关,实验证明C/EBPα通过PPARγ通路促进BMSCs的成脂分化,具体机制是C/EBPα通过抑制 HDAC1上调PPARγ启动子区域的H3K27乙酰化水平,阻止脂肪分化,从而减缓激素性ONFH 的进展[22]。HDAC9与ONFH的成骨相关信号通路有关,在临床上发现激素性和酒精性ONFH患者HDAC9c-S水平显著上调[23]。当敲低HDAC9后发现,经过MAPK 信号通路抑制hBMSC的成骨分化[24]。另外下调HDAC9将诱发 BMSCs的成骨及成血管能力降低,成脂能力升高[25]。成骨分化降低导致低骨量,而低骨量与骨特异性基因启动子的 H3K27乙酰化减少有关[26]。

2.2 组蛋白去甲基化修饰与股骨头坏死

组蛋白去甲基化酶可根据特殊结构域的不同分为两类:一个是具有Tower结构域的组蛋白去甲基化酶家族(lysine-specifichistone demethylase,LSD);另一个含Jumonji C(JmjC)结构域。后者为已知最大的一类组蛋白去甲基化酶,并根据不同结构域分为KDM2、3、4、5、6、7亚家族[27]。

研究证明KDM4A 的过表达促进了BMSC成骨分化[28]。在血瘀型激素性ONFH中,KDM6A mRNA减少[29]。KDM4A 直接结合 Sfrp4和C/ebpα的启动子,去除组蛋白甲基化标记 H3K9me3,并降低二者启动子区域CpG的DNA甲基化水平[30]。

KDM5家族是一个重要的表观遗传状态修饰酶家族,包含5个保守结构域:JmjN、ARID、JmjC、PhD 和一个 C5HC2 锌指[31]。包括KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D。KDM5A是BMSCs成骨分化的负调控因子,KDM5B作为一种成骨、成肌细胞分化的负调控因子参与Runx2的双位点表观遗传调控[32]。

KDM5D是一种男性特异性蛋白[33]。在肾虚血瘀型激素性ONFH大鼠中发现沉默KDM5D基因导致BMSCs中Runx2、OPN、OCN降低[34]。KDM5D在人类成年男性神经嵴衍生干细胞(NCSC)分化时高度上调,使 H3K4me2/H3K4me1去甲基化。并且与女性NCSC相比,KDM5D是男性NCSC更快成骨分化的主要驱动因素,若KDM5D 的药理学抑制显著降低了雄性成骨分化能力[35]。

系统性红斑狼疮(SLE)男性患者的Y染色体上的两个基因KDM5D和RPS4Y1发生下调[36]。在存在SLE但无ONFH组发现KDM5D表达降低,而激素组与SLE组比较,差异表达倍数前20的基因包含KDM5D,说明激素明显影响KDM5D[34]。与野生型小鼠相比,缺少Y染色体以及KDM5D功能丧失突变的小鼠在甲基化水平上没有差异,因此Y染色体的遗传变异影响常染色体区域的DNA甲基化水平[37]。综上,已知SLE患者会在临床上大量使用激素会导致ONFH,而ONFH的男性患病率又高于女性,可能男性ONFH易感性与KDM5D的高水平有关。

KDM6A与骨细胞的生成有关,Xia等[38]证实表达骨基质酸性蛋白的成骨细胞/骨细胞中的组蛋白去甲基化酶(UTX,又称KDM6A)通过H3K27 me3 修饰正向调节成骨细胞的分化。Wang等[39]证明UTX 减弱激素对成骨和成脂的失调,具体是减少Dkk1启动子中的 Runx2启动子甲基化和H3K27 me3富集,而β-catenin和Dkk1又可调节激素对UTX的抑制。UTX 抑制会加剧骨量丢失、骨小梁破坏和脂肪堆积。

2.3 组蛋白甲基化修饰与股骨头坏死

H3K27 me3是常见的组蛋白甲基化修饰之一,具有转录抑制作用,与靶基因及mRNA的转录和翻译呈负相关[40]。Zhang等[41]发现缺氧经过HIF-1α/EZH2信号轴促进LncRNA Tmem235启动子H3K27 me3的修饰,抑制其表达,导致BMSCs缺氧凋亡。Bitirim等[42]证实经雌激素处理后脂肪形成相关基因的H3K27 me2和H3K27 me3增加可能是由雌激素受体α和组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶(EZH2)的直接相互作用介导的,雌激素调节 H3K27甲基化从而抑制MSC的脂肪分化,说明具有表观遗传转换开关的作用。因此可以从表观遗传学上分析高龄女性易发生骨病的原因,随着年龄增加,内源性雌激素水平下降,使抑制性的组蛋白修饰物减少,导致BMSC的脂肪分化不受抑制,最后导致骨细胞水平下降,骨含量减少,诱发ONFH。

3 RNA甲基化与股骨头坏死

N6-甲基腺苷 (m6A) 是真核细胞中最丰富的RNA甲基化修饰类型,广泛存在于真核细胞的mRNA和非编码RNA中[43]。

Cheng等证明通过m6A使甲基转移酶(METTL14)增加 PTPN6 mRNA 的m6A修饰,并增强稳定性,以此上调 PTPN6,进而加强METTL14对激素性ONFH的BMSCs的增殖和成骨分化[44]。

FTO是一种m6A去甲基化酶,并且研究发现FTO rs62033406 A>G是中国汉族人群ONFH的危险因素[45]。YTH家族中的YTHDF1蛋白主要通过与mRNA的m6A位点结合发挥作用[46]。FTO在骨质疏松症和骨坏死患者中显著下调,并且FTO 以YTHDF1依赖性方式介导 PPARG-mRNA 3'UTR 中的m6A去甲基化,并降低PPARG mRNA 稳定性,另外PPARG 的过表达会减轻FTO介导的BMSC成骨分化[47]。

4 中医药基于表观遗传学治疗股骨头坏死进展

4.1 中医药调控DNA甲基化治疗股骨头坏死

研究发现淫羊藿苷可能通过ABCB1启动子去甲基化使类固醇相关性骨坏死患者的MSCs受益[48]。左归丸使Runx2、Osterix、OC、β-catenin基因去甲基化从而促进BMSCs向成骨细胞分化[49]。葛根素抑制雌激素受体的启动子甲基化及增加其mRNA表达从而促进成骨细胞增殖分化[50]。

4.2 中医药调控组蛋白甲基化治疗股骨头坏死

在调控组蛋白修饰方面,证明新橙皮苷(neohesperidin,NH)通过抑制 lncRNA-HOTAIR与lncRNA-SNHG1的组蛋白修饰来改善类固醇诱导的股骨头坏死,NH增加了BMSCs的活力和HOTAIR与SNHG1的H3K27 me3占有率,但降低了二者的表达及H3K4me3的占有率[51-52]。活血通络胶囊通过抑制lncRNA-MIAT 改善股骨头坏死,具体机制是由于显著增加了MIAT启动子区域中H3K27 me3的占有率并减少了H3K4me3[53]。毛壳素处理绒山羊脂肪间充质干细胞后可以显著降低组蛋白H3K9 me2和H3K9 me3的甲基化修饰作用[54]。补肾健脾活血方促进组蛋白去甲基化酶JMJD2B的表达进而促进BMSCs成骨分化[55]。仙灵骨葆胶囊可通过抑制miR-100-5p的表达促进JMJD3/RUNX2通路的激活促进成骨细胞分化[56]。

4.3 中医药调控组蛋白乙酰化治疗股骨头坏死

白藜芦醇可以在骨关节炎[57]、绝经后骨质疏松[58]中发挥促成骨作用,在股骨头坏死中也不例外,大量实验发现白藜芦醇调控去乙酰化酶对不同种骨细胞,如(前)成骨细胞、(前)破骨细胞、间充质干细胞发挥作用。实验证实白藜芦醇通过增强 SIRT3 表达并降低大鼠的氧化水平,通过激活 AMPK/PGC-1α/SIRT3 轴促进BMSCs 成骨分化[17]。白藜芦醇通过SIRT1激活至少部分地通过减弱 p44/p42 MAP 激酶通路来抑制 IGF-I 诱导的成骨细胞迁移[59]。白藜芦醇通过提高SIRT1、Runx2、ALP等成骨因子的表达从而对前成骨细胞发挥骨保护作用[60]。白藜芦醇通过上调SIRT1而增强成骨细胞的增殖,并抑制DEX诱导的成骨细胞线粒体自噬的发生[61]。白藜芦醇通过激活导致成骨细胞分化的SIRT1和 Runx2 来反转 TNF-β和NAM抑制的BMSCs成骨[62]。对于破骨细胞,白藜芦醇通过激活Sirt1而上调FoxO1从而抑制破骨细胞的形成[63]。

虾青素在乙醇处理的巨噬细胞中的抗炎和抗氧化特性可能至少部分是通过其对 SIRT1 和HDAC4的相反作用来介导的,从而使SIRT1能够抵消乙醇诱导的HDAC4激活[64]。乙醇显著降低了SIRT1 性和细胞NAD+水平,但虾青素显著减弱了RAW 264.7减少,并上调SIRT1[65]。水飞蓟宾抑制氧化应激以促进成骨分化。此外证实通过激活SIRT1/SOD2信号通路促进MC3T3-E1的成骨分化[66]。蓝莓汁部分通过 SIRT1 保护骨细胞和骨前体细胞免受氧化应激[67]。活骨灌注液可促进SIRT1核转移和LC3蛋白介导自噬泡形成使细胞自噬水平增加,拮抗地塞米松对BMSCs活力及成骨分化和钙化的抑制作用[68]。岩白菜素可以促进骨髓间充质干细胞BMSC的成骨分化并抑制其成脂分化,RUNX2、COL1A1和SIRT1的表达水平显著增加,PPARγ蛋白表达减少[69]。芫花素升高ALP、Runx2表达,下调HDAC1而促进MC3T3-E1向成骨细胞分化[70]。研究证实,姜黄素可作为表观遗传开关,通过抑制 EZH2 特异性调节成骨细胞分化,并显着提高了成骨标志物的表达水平,包括 Runx2、Osterix、骨桥蛋白和骨钙素[71]。海参肠肽(SCIP)显著促进MC3T3-E1细胞的增殖和矿化结节,增加软骨细胞向成骨细胞的分化。而SCIP 补充剂通过整合素介导的组蛋白乙酰化诱导软骨细胞去分化为骨祖细胞,然后通过Wnt/β-catenin 信号转导再分化为成骨细胞[72]。

4.4 中医药调控RNA甲基化治疗股骨头坏死

中药小分子蟛蜞菊内酯可靶向结合RNA甲基化酶Nsun4,调控Nsun4的表达,进而调节RNA的m5C甲基化水平,促进BMSCs成软骨分化[73]。墨旱莲提取物升高BMSCs成骨分化过程中总RNA的m6A甲基化水平,促进了甲基化转移酶METTL3、METTL4表达水平[74]。

5 总结与展望

综上所述,表观遗传在ONFH对BMSC的成骨与成脂分化、血管生成,骨细胞凋亡、坏死等途径发挥重要的调控作用。在临床上通过采集ONFH患者坏死股骨头组织、尿液样本进行检测分析,发现异常高DNA甲基化、组蛋白修饰、ncRNA等表观遗传修饰与ONFH的进程密切相关,这表明表观遗传的改变与ONFH成一定相关性。

虽然表观遗传学发展迅速,但基于此过程的治疗多集中在动物模型尚未在临床中推广应用。随着对股骨头坏死发病机制中表观遗传学修饰的认识的不断提高,希冀找寻一种新的表观遗传的临床治疗方法,从而达到抑制成脂分化、促进成骨分化、减少成骨细胞程序性死亡等目的。因此,更多的中医药实验研究来详细地描述表观遗传学在ONFH参与机制,并运用其实现临床价值。