美沙拉嗪联合蒲公英多糖治疗溃疡性结肠炎中炎症因子及髓过氧化物酶相关性的研究

周亚妮，姜鹏涛，李会荣

溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是一类发病原因不明确的慢性特发性肠道炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，病程迁延且反复发作[1]。过去该病在西方国家发病率较高，但近年来其在我国的发病率呈明显升上升趋势。蒲公英具有抗菌、抗突变、抗肿瘤、抗氧化等多种药理学作用[2]。有研究[3-4]显示，蒲公英多糖对UC大鼠白细胞介素(IL)-6/STAT3通路的作用，对血清中的IL-6及结肠组织中的髓过氧化物酶(MPO)有影响。蒲公英水提物对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的UC大鼠模型血清中炎性因子IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平表达有影响作用[5]。有研究[6]显示蒲公英对小鼠痤疮模型炎症因子IL-8水平有调节作用。近年来，5-氨基水杨酸(5-ASA)制剂灌肠治疗UC疗效明显，其中美沙拉嗪治疗TNBS/乙醇诱导的UC大鼠，提高了抗炎因子IL-4水平，并降低了促炎因子IL-6水平[7-8]。目前炎性因子的表达成为研究UC发病发展的热点，但在UC发病中针对炎性因子与MPO的表达相关性方面研究较少，因此，该研究拟以建立TNBS/乙醇大鼠UC模型为基础[9]，采用蒲公英多糖联合美沙拉嗪对UC大鼠模型进行干预，检测炎症活动期大鼠血清中炎性因子IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α含量以及结肠组织中MPO 水平，探讨血清中炎症因子与结肠组织中MPO在UC活动期的相关性，为临床UC的诊断和治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 采用雄性Wistar大鼠50只，6～8周龄，体质量180～220 g，购自西安交通大学医学部实验动物中心[SCXK(陕)2015-0009]。动物饲养设施符合相关标准[SYXK(陕)2013-0210]。所有动物实验均遵照国家实验动物使用指南。

1.1.2 主要试剂和仪器 实验用蒲公英购自陕西省西安市怀仁堂中药店(小寨店)，并经生药鉴定为正品。5%TNBS溶液购自北京天根生物技术有限公司(批号：160712)；美沙拉嗪缓释颗粒剂购自法国爱的发制药公司(批号:20140202)，规格每袋0.5 g，10袋/盒；IL-6 ELISA试剂盒、IL-4 ELISA试剂盒购、IL-8 ELISA试剂盒购、IL-10 ELISA试剂盒购、TNF-α试剂盒购自上海科美生物科技有限公司；紫外分光光度检测仪器购自购自德国Eppendorf公司，高速离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司、显微镜购自上海光学仪器厂，电子天平购自德国Sartorious公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及TNBS/乙醇大鼠UC模型建立 SPF级SD雄性大鼠50只，适应性生活72 h，随机抽取10只大鼠作为正常对照组，其余40只大鼠进行造模。TNBS-乙醇的UC动物模型参照文献[9]建立。造模前均禁食24 h，用10%水合氯醛(0.30 mL/100 g，现配)腹腔注射麻醉后，用聚丙烯管插入肛门上段8 cm一次性缓慢注入TNBS/50%乙醇混合液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇)0.25 mL，诱导急性结肠炎。观察到大鼠毛色暗淡、精神萎靡、食量减少且出现黏液脓血便或便潜血试验阳性，3 d后，取正常对照组和模型组各2只大鼠进行解剖，并分别抽取腹主动脉血分离血清标记保存待测。参照相关标准[10]，确认造模成功后，将造模大鼠随机分成模型对照组、美沙拉嗪治疗组、蒲公英治疗组以及美沙拉嗪与蒲公英联合治疗组(联合治疗组)。

1.2.2 蒲公英多糖提取物的制备 (1)预处理材料，将100 g干燥蒲公英用中草药粉碎机磨成粉末，过80目筛备用。(2)脱脂，将蒲公英根粉末用滤纸包好，放入索氏提取器中，于50 ℃条件下石油醚回流脱脂3～4 h。(3)单糖和寡糖的去除，将脱脂后的滤纸包风干，再用80%乙醇回流2 h。(4)热水浸提，将回流后的滤纸包风干，各取5 g进行单因素及正交试验。(5)除蛋白，用木瓜蛋白酶解蛋白。(6)醇析，向提取液中缓缓加入95%乙醇，并用玻璃棒缓慢搅拌，使乙醇体积分数达到80%，静置4 h，以转速4 000 r/min离心5 min。(7)浓缩，取离心后的上清液，用旋转蒸发器进行蒸发浓缩至原体积的1/3。(8)纯化，浓缩后的溶液用80%乙醇沉淀蒲公英根多糖，以转速4 000 r/min离心5 min，多糖沉淀分别用无水乙醇、丙酮洗3次，真空干燥得精制多糖[3]。

1.2.3 分组灌胃治疗 模型复制成功后，第3天开始灌胃给药：正常对照组，按照剂量为1 mL·100 g-1·d-1(约2 mL)计算，以0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次；模型对照组，按照剂量为1 mL·100 g-1·d-1(约2 mL)计算，以0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次；美沙拉嗪组，按照剂量为每次1 mg·100 g-1·d-1美沙拉嗪灌胃，每天1次；蒲公英多糖组，按照剂量为每次1 mg·100 g-1·d-1蒲公英多糖灌胃，每天1次；联合治疗组，剂量为美沙拉嗪1 mg·100 g-1·d-1和蒲公英多糖1 mg·100 g-1·d-1联合灌胃，每天1次。以上各组灌胃均持续14 d。

1.2.4 标本采集 末次给药后，各组大鼠禁食24 h后眼眶取血，以3 000 r/min离心15 min，分离血清，置-20 ℃低温冰箱保存。

1.2.5 ELISA法测定血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α水平 将待用血清从-20 ℃冰箱中取出放入4 ℃冰箱中溶解24 h，于实验前1 h放至室温待全部溶解，轻轻摇晃混匀，以免出现沉淀。严格按照酶联免疫分析试剂盒使用说明书进行操作，操作完成后使用自动化酶标仪分光光度计测定450 nm处吸光度值分别计算血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α浓度。

1.2.6 Western blotting法检测结肠黏膜组织中MPO的表达 剪取大鼠炎症明显处4块结肠组织约50 mg，用PBS冲洗，剪碎并加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液500 μL，研磨匀浆提取蛋白，经 BCA 定量蛋白浓度后，进行SDS-PAGE电泳，蛋白转印至活化的PVDF膜上，5%脱脂牛奶中室温封闭2 h，MPO 抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3遍，每遍10 min，加入二抗( 1∶5 000) 室温孵育1 h，TBST洗涤3遍，每遍10 min，滴加ECL进行化学曝光，显影、冲洗胶片并扫描分析，对目的条带做灰度分析，以目的蛋白的灰度值比内参GAPDH 的灰度值校正误差，比较蛋白表达情况。

1.3 统计学方法 采用方差分析、q检验和Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血清血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α表达水平 与正常对照组比较，模型对照组、蒲公英多糖组血清IL-6、IL-8和TNF-α水平升高，IL-4和IL-10水平降低(P<0.05)，美沙拉嗪组血清IL-6和TNF-α水平升高，IL-4和IL-10水平降低(P<0.05)，联合治疗组与正常对照组比较各因子水平差异无统计学意义(P>0.05)；与模型对照组比较，美沙拉嗪组、蒲公英多糖组和联合治疗组血清IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，IL-4和IL-10水平升高(P<0.05)；与美沙拉嗪组、蒲公英多糖组比较，联合治疗组血清IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，IL-4和IL-10水平升高(P<0.05)(见表1)。

2.2 蒲公英多糖对结肠炎大鼠结肠组织中MPO表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组、蒲公英多糖组和美沙拉嗪组结肠组织中MPO的含量升高；与模型对照组比较，美沙拉嗪组、蒲公英多糖组和联合治疗组结肠组织中MPO的含量降低；与美沙拉嗪组、蒲公英多糖组比较，联合治疗组MPO的含量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

2.3 血清中细胞因子与结肠组织中MPO的变化关系分析 结肠炎大鼠模型中，IL-6(r=0.852)、IL-8(r=0.614)、TNF-α(r=0.426)表达水平与MPO水平呈正相关关系，IL-4(r=-0.106)和IL-10(r=-0.086)表达水平与MPO水平呈负相关关系(P<0.05)。

表1 药物灌胃后血清中几种细胞因子水平的表达

表2 药物灌胃后结肠组织中MPO的含量(U/g)

3 讨论

UC的病因尚不完全清楚，但可以确定的是异常免疫反应在UC的发展中起着至关重要的作用。随着人民生活水平的提高和生活节奏加快，我国UC的发病率也出现逐渐增高趋势[11]。TNBS/乙醇诱导的UC模型在临床症状、组织学和微观方面与人类 UC 相似，具有很好的结肠损伤及肠上皮屏障破坏的发病特征，适合筛选UC潜在治疗药物[12]。

蒲公英多糖能够显著抑制炎性动物模型体内IL-6mRNA的表达，异常免疫反应它激活了UC发病的标志物活性氧/氮物质(ROS/RNS)生成系统，导致血清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8等过度产生，而抑炎因子IL-4、IL-10降低，炎症反应逐级放大[13-16]。MPO由中性粒细胞分泌，其活性是中性粒细胞浸润的重要指标，也能间接反映肠道炎症活动程度。有研究[16]表明，TNBS肠腔灌注的造模方法构建炎症性肠病动物模型，模型组大鼠MPO水平显著增高。结合蒲公英的药理活性和UC发病的异常免疫特点，我们以蒲公英多糖为目标药物，通过与近年来治疗UC新型替代性5-ASA制剂的美沙拉嗪联合灌肠，考察蒲公英多糖在治疗UC大鼠的作用中，细胞因子IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α表达水平与结肠组织中MPO变化相关性分析。本实验研究显示，UC模型对照组大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α水平高于正常对照组，而IL-4和IL-10水平低于正常对照组；模型对照组大鼠结肠组织中MPO水平高于正常对照组。给予3种药物灌肠治疗后发现，蒲公英多糖组、美沙拉嗪组大鼠分别与模型对照组大鼠比较，细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α降低水平和IL-4、IL-10升高水平均有统计学意义。本研究还发现，联合使用美沙拉嗪和蒲公英多糖大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平以及结肠组织中MPO含量显著降低，IL-4、IL-10 水平显著升高，且与美沙拉嗪组和蒲公英多糖组的差异有统计学意义，认为联合用药对治疗UC有更好的疗效，进一步说明，蒲公英多糖对UC的传统用药美沙拉嗪有协同治疗作用，这与宋雨鸿等[17]研究结果相一致。因此，笔者认为，炎症因子L-6、IL-8、TNF-α为促炎因子，对于UC炎症的进程起推进作用，MPO作为肠道炎症活动程度的一项指标也得以证明。IL-4、IL-10作为2种主要的抗炎因子，在抑制UC炎症发生及促进疾病转归方面都起到重要的作用[18]。

本实验通过评价大鼠血清中IL-6、IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α表达水平与结肠组织中MPO含量，认为联合使用美沙拉嗪和蒲公英多糖治疗UC模型大鼠比单独一种药物抗炎效果更佳，其可能的机制为减少血清促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α的释放以及结肠组织中MPO的表达，并上调抑炎因子IL-4、IL-10阻断炎症的放大效应。进一步证明，蒲公英多糖对美沙拉嗪治疗UC有协同作用，这为UC的临床诊断和药物疗效评价提供实验依据。