噬菌体治疗在畜牧业中的应用

文 英,谭 俊,马梦真,袁修磊,何 博,常建军*,马文涛*

(1.青海大学农牧学院,青海西宁 810016;2.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100;3.平罗县畜牧水产技术推广服务中心,宁夏平罗 753400 )

随着畜牧业的蓬勃发展,畜牧生产逐渐转向规模化,在发展过程中如何防治细菌病也成为了亟待解决的问题[1]。抗生素因其高效性成为防治动物细菌病的首选,但也因此导致了行业内对抗生素的滥用,使部分细菌产生了耐药性,导致抗生素的效果有所减弱。同时,滥用抗生素也存在动物体内药物残留的风险,这引起了动物制品加工困难,且可能对人类的健康造成危害[2]。长期大量、随意地使用抗生素会使一部分细菌产生抗性,这种具有抗性的细菌在动物体内或是环境中生存繁殖,相应的抗性基因就得以保留传播,导致临床上人类进行抗生素治疗的效果减弱[3]。抗生素在人类医疗系统中发挥着重要作用,抗生素治疗被广泛认为是医学史上最成功的治疗干预措施之一,对包括器官移植和癌症化疗在内的多项医学突破发展起到了关键作用。而我们正在接近抗生素逐渐失去作用的“抗生素后时代”[4]。

噬菌体是感染细菌的病毒,具有病毒的所有共同特征。噬菌体不能自己复制,需要细菌宿主来复制,大小约50～200 nm,由包含双链DNA的头部和特异性识别受体的尾部组成,根据噬菌体尾部特征可以将其分为长尾噬菌体科、肌尾噬菌体科和短尾噬菌体科[5]。有数据表明,生物圈中有大约1 031种噬菌体,它们广泛存在于土壤、污水等[6],有细菌存在的地方就可能有噬菌体的存在。此外,噬菌体的特异性高,可以精确地感染特定的病原菌,减少对正常微生物群落的干扰。噬菌体可以通过整合细菌DNA的方式,使细菌恢复对抗生素的敏感性,从而对抗耐药性的产生。随着对噬菌体的研究不断深入,噬菌体治疗已经在畜牧行业中有较大的应用价值[7],其在畜牧行业和人类临床中的治疗作用逐渐展现。

1 噬菌体治疗的发展

100多年前,D′Herelle F首先发现了噬菌体,并立即提出用于人类和动物传染病的治疗[8]。他曾设想噬菌体疗法会成为主要对抗细菌感染的治疗方法。但是,随着1928年青霉素的横空出世[9],这种设想并未实现。噬菌体研究也陷入了低谷,但并未被完全放弃,在前苏联和波兰等地,噬菌体疗法稳步发展。在噬菌体方面研究历史最悠久的机构是由格鲁吉亚微生物学家乔治·埃利亚瓦于1923年创立的埃利亚瓦噬菌体微生物学和病毒学研究所,以及1952年在波兰弗罗茨瓦夫成立的路德维克·赫兹菲尔德免疫学和实验疗法研究所[10]。

D’Herelle F于1919年第一次使用噬菌体的噬菌斑治愈了1例痢疾,这是人类历史上首次使用噬菌体进行疾病治疗并取得成功[11]。之后的1920-1940年是噬菌体发展的“黄金时期”,噬菌体治疗试验扩大至霍乱、痢疾、腺鼠疫、结膜炎、皮肤感染等[12]。直至抗生素的黄金时期过后的1983-1986年,Slopek Smith &Huggins噬菌体疗法在人类和多种动物模型中对抗抗生素耐药性细菌菌株感染[13]。2017年,Schooley R T等[14]成功将噬菌体静脉注射给个体治愈鲍曼不动杆菌导致的败血症。噬菌体治疗在新型抗生素研发以及减少和耐药菌株不断出现的背景下再次兴起,针对噬菌体感染机制的研究也取得了较大的进展。

目前噬菌体基因工程的应用也十分广泛,已有几种噬菌体基因组工程技术被开发出来,包括噬菌体与质粒重组、穿梭质粒构建、直接克隆、重组、CRISPR-Cas选择以及重组与crispr介导的反选择[15]。

2 噬菌体的给药途径

Payne R J等[16]将噬菌体治疗分为“被动”治疗和“主动”治疗。“被动”治疗提供足够剂量的噬菌体杀死目标细菌,即淹水密度,不需要噬菌体通过细菌增殖即可控制感染。“主动”治疗则需要噬菌体在细菌感染期间增殖,相对于“被动”治疗,其更依赖于噬菌体裂解宿主菌并进行增殖能力,较少依赖于噬菌体本身的浓度[17]。不同的给药途径也会使噬菌体作用时的浓度有所不同,不同的疾病也应选择不用的给药途径。临床上目前所使用的给药途径有注射以及口服给药、局部给药等。

2.1 注射给药

注射给药是最容易通过机体屏障的给药方式,已经被证实是系统递送噬菌体最有效的途径。注射给药可以快速地将噬菌体送入血液中,大约1 h后可以在血液中检测到有活性的噬菌体,最快的甚至在5 min左右即可检测到[18]。在临床动物模型中,噬菌体的腹腔注射、静脉注射和肌肉注射已有报道。

在美国食品和药物管理局以及紧急新药研究制度的推动下,有因植入假体而导致铜绿假单胞菌持续感染,多次注射抗生素都无效的患者使用静脉注射噬菌体OMKO1,该噬菌体与铜绿假单胞菌外膜蛋白M结合,且以该结合点为靶点,使该患者对头孢他啶的敏感性增加了2倍,对化学合成的环丙沙星的敏感性增加了10倍。除对抗生素敏感性的影响外,其对铜绿假单胞菌的特异性消灭作用也使得患者生物膜保持完整无菌[19]。

在急性小鼠肺部洋葱伯克霍尔德菌感染模型中,将鼻吸入与腹腔注射两种途径治疗的小鼠肺部细菌载量和肺部炎症进行对比,腹腔注射组的治疗效果要优于鼻吸入组[20]。不同的注射方式会影响噬菌体进入血液的时间,但静脉注射是最有效的方式,通过在感染部位局部注射噬菌体进行治疗除外[21]。McVay C S等[22]研究证明,相较于腹腔注射和肌肉注射,静脉注射在治愈患有败血症的动物时具有更高的效率和更好的治疗效果。

2.2 口服给药

在各种给药途径中,口服给药是最容易被接受的一种给药途径。但是口服给药并不能使噬菌体有效地进入体循环,胃肠道对噬菌体的吸收作用并不乐观,并且不能通过剂量来解决。Monsur K A等[23]的研究显示,在对霍乱患者进行口服噬菌体治疗时,高噬菌体摄入量(1013～1014PFU)也不能使胃肠道对噬菌体的吸收量增加,血液中检测到的噬菌体数量仅为1012PFU/mL 。Jun J W等[24]的研究显示,注射给药时噬菌体在血液中出现的时间比口服给药快3 h,更是提前6 h达到峰值。在口服T4噬菌体进行的人体安全试验中,血液中始终未出现具有活性的噬菌体[25]。

对于治疗胃肠道感染,口服给药仍然是一种较为有效的途径。在口服给药之前,需对噬菌体进行特殊处理。噬菌体对于极端pH尤其敏感,如果不克服胃酸造成的障碍,机体对于噬菌体的吸收将十分低效[26]。因此,口服给药时噬菌体通常与胃酸中和剂一起使用[27]。Otero J等[28]将噬菌体包裹在脂质体中给小鼠口服,结果表明该方法可以使噬菌体长时间在胃酸中存活并增加了肠道对于噬菌体的吸附力。

2.3 局部给药

局部给药大多数是将噬菌体应用于生物膜表面。生物膜中的细菌具有多种免疫和抗生素规避机制,使得生物膜相关感染难以根除,噬菌体是治疗生物膜介导的肌肉骨骼感染的潜在方法[29]。噬菌体可通过局部给药直接接触病原菌,对于一些黏膜感染或是皮肤表面创伤,局部给药相较于注射给药和口服给药有更好的治疗效果[30]。用于皮肤创伤治疗的噬菌体,可以直接与造成感染的病原菌接触,噬菌体不必进入体循环,也不必为了与目标菌株接触而进行移动。

吸入性的噬菌体给药可对肺部感染小鼠模型有良好的治疗作用,且有剂量依赖性,效果优于注射给药[31]。Milho C等[32]在猪皮上利用噬菌体进行治疗试验,结果显示噬菌体对鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌等造成的伤口感染有明显的治疗效果。

3 噬菌体治疗在畜牧行业中的应用

3.1 噬菌体治疗在禽类养殖中的应用

在禽类中常见的造成禽类伤亡严重的病原菌有大肠埃希氏菌属、沙门氏菌属、弯曲菌属等。已经证实,在家禽中长期使用噬菌体已经被证实能够有效地减少肠道中的沙门氏菌[33]。正如Fiorentin L 等[34]的研究所示,口服噬菌体剂量为1011PFU能够有效降低沙门氏菌所导致的鸡的肠炎。并且作者也证实这种作用具有剂量依赖性。将噬菌体添加在雏鸡日粮中能够有效降低沙门氏菌在雏鸡肠道中感染,这种预防措施也减少了沙门氏菌在肠道中的复制[35]。李梦哲等[36]通过生物信息学分析筛选出了具有较为宽泛宿主范围的沙门氏菌噬菌体STP4-α,该噬菌体对91株沙门氏菌中的88株都有抑制作用,并且在体外模拟的胃肠道环境中保持了50%以上的活性,使用STP4-α对雏鸡预处理,在雏鸡粪便中检测不到沙门氏菌,该噬菌体对于沙门氏菌有较好的抑制效果,有作为治疗药物的潜力。

有研究显示,噬菌体对于新生以及3周龄大小的由大肠埃希氏菌导致的脑膜炎和脓毒症的雏鸡有良好的治疗作用[37]。吴立婷等[38]分离到1株禽源产气荚膜梭菌噬菌体,该噬菌体对于多种产气荚膜梭菌有裂解作用,在环境消减测试中观察到噬菌体作用0.5 h,杀菌效率可达98.36%;作用2 h能够抑制99.60%的产气荚膜梭菌,为食品动物养殖及禽类产品中产气荚膜梭菌的控制提供了一种可靠的方法。

3.2 噬菌体治疗在哺乳动物中的应用

金黄色葡萄球菌引起的奶牛、奶山羊乳房炎是奶畜行业的一个重要问题,如今有相当数量导致动物乳房炎的金黄色葡萄球菌对抗生素具有耐药性,且治疗后容易复发[39]。Erol H B等[40]测试了5种市售金黄色葡萄球菌噬菌体“鸡尾酒”悬液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的影响,发现噬菌体对菌株裂解率高,为奶畜乳房炎的治疗提供了一种新的可能性。Gill J J等[41]对24头金黄色葡萄球菌导致的隐性乳房炎荷斯坦奶牛采用对金黄色葡萄球菌具有裂解作用的噬菌体K让奶牛口服进行治疗,与生理盐水的对照组相比,治愈率有显著差异,并且反复论证,发现长疗程比短疗程效果更好。党瑞莹等[42]分离出1株具有裂解金黄色葡萄球菌作用的噬菌体P82,其效价高、噬菌谱广、裂解能力强、增殖速度快,为奶牛乳腺炎的噬菌体治疗提供了材料。Mishra AK等[43]使用噬菌体对耐药性金黄色葡萄球菌进行裂解,也发现其对于临床中奶山羊乳房炎的治疗效果显著。

仔猪成长过程中感染致病菌会出现腹泻、生长发育迟缓等。Seo B J等[44]给28日龄仔猪的饲料中添加噬菌体鸡尾酒,发现这些仔猪感染沙门氏菌的风险将显著降低,同时不会对仔猪肠道菌群产生不良影响。Desiree K等[45]将噬菌体对仔猪治疗结果进行分析对比,发现噬菌体可以有效降低仔猪体内目标细菌浓度,作者也发现将噬菌体添加进猪饲料中饲喂比直接灌服噬菌体在盲肠中的存活率更高。王兆飞等[46]从链球菌噬菌体phi5218中分离出具有裂解链球菌作用的裂解酶,将其命名为Ply5218,在小鼠感染模型中该酶对链球菌裂解效果明显,对不同血清型链球菌均有效,也能够缓解链球菌引起的仔猪临床症状,有望用于猪链球菌感染性疾病的治疗。

4 小结与展望

迫在眉睫的抗生素耐药性威胁,让人们将目光更多地转向寻找替代抗生素治疗的方法,噬菌体是一种天然且广泛存在的病毒粒子,生产成本低、安全性高,一旦宿主细菌消失,噬菌体也会随之被机体代谢排出。细菌与噬菌体共同进化了数百万年,两者之间的相互作用像是“军备竞赛”[47],即使一部分细菌会进化出抵抗噬菌体表型,噬菌体也会做出相应的改变对抗细菌的进化。噬菌体治疗有望成为替代抗生素治疗细菌病的一种主要方法。

目前对于噬菌体的研究还有很多不足之处,例如临床数据较少、监管体系和相关知识产权保护政策尚不完善、已经研究发现的噬菌体种类不足等。此外,噬菌体本身的高度特异性会使其作用范围受限。这些因素均使得噬菌体治疗距离真正得到广泛应用还需要进行一段时间的研究探索。但是噬菌体治疗正在迅速发展,其所带来的经济效益和对医疗健康发展的推动作用将十分显著,噬菌体作为一种绿色生物制剂,一定会对养殖行业和人类健康带来积极影响。