猪繁殖与呼吸综合征疫苗的发展现状及mRNA疫苗前景

周洛译,孙跃峰,侯石桐,张 杰

(1.河北科技师范学院,河北秦皇岛 066600;2.中国农业科学院兰州兽医研究所,甘肃兰州 730030)

当今世界,猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)已成为猪业生产中最为棘手的问题之一。PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种RNA病毒,易于发生变异和重组,给全球的养猪业带来了巨大的经济损失[1]。传统的疫苗技术,如灭活疫苗和弱毒活疫苗等,已经在猪的预防和控制中发挥了重要作用,但由于病毒的高变异性和复杂性,这些传统疫苗的防控效果仍然有限[2]。

近年来,mRNA疫苗技术的发展和突破给养猪业生产带来了新的希望。相比传统疫苗,mRNA疫苗具有制备时间短、生产成本低、安全性高、效力持久等诸多优势。通过输入目标抗原的mRNA序列,mRNA疫苗可以迅速激发机体免疫反应,从而达到预防和控制PRRS的目的[3]。

然而,mRNA疫苗技术在猪繁殖与呼吸综合征的防控中的应用还处于初步阶段,需要更多的研究和实践来验证其有效性和安全性。未来,研究者通过不断探索和创新,进一步完善mRNA疫苗技术,并将其应用于更广泛的猪类疫病的预防和控制中,为养猪业生产的可持续发展贡献更多的力量。

1 猪繁殖与呼吸综合征及其防控现状

1.1 猪繁殖与呼吸综合征和猪繁殖与呼吸综合征病毒概况

PRRS是一种猪的流行性疾病,主要症状表现为不同生长阶段猪只的繁殖系统及呼吸系统疾病,例如母猪流产、死胎或仔猪易夭折、发热、出血及呼吸道综合征等。因发病猪只明显表现出蓝紫色双耳,又被称为“猪蓝耳病”。由于其极大的传染性及危害程度,PRRS已经被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)列入必须报告的传染病,被我国列入二类动物传染病。PRRS已经成为了影响世界养猪业发展的主要疾病之一。

PRRSV是一种动脉炎病毒属的单股正链RNA病毒,同属的病毒还有猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒(Lactate dehydrogenase elevation virus,LDV)和马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)。PRRSV主要有PRRSV-1型和PRRSV-2型两种基因型,两者都已呈现出全球流行的趋势。在我国流行的毒株主要为PRRSV-2型,其中以2006年突然暴发的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)为典型。

1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的理化性质与抗原性质

PRRSV的核衣壳呈光滑的20面体对称,直径在30 nm左右,其外覆有一层囊膜。毒粒对酸碱(pH<6.5或pH>7.5)和高温(比如60 ℃下暴露40 min)不耐受,但在中性的低温环境下存活时间较长,易被有机溶剂等脂溶性溶剂破坏其结构[1]。

PRRSV基因组长约15.4 kb,包含至少10个开放阅读框(ORFs),编码至少14种非结构蛋白(NSP)和GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M和N 8种结构蛋白。Nsp2基因是基因组中变异最大的区域,这对毒粒结构的改变产生了极大的影响,同时也可作为PRRSV变异与进化的检测标准[4]。

1.3 猪繁殖与呼吸综合征传统疫苗和研发中的新型疫苗

PRRSV是一种极易变异的病毒,这给PRRS疫病的防控和治疗带来了极大的困难。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗无法满足PRRS的防控需求, Zhou L等[2]经过大量的计算和比对得出结论,对于PRRSV的免疫注定是一种多因素效应。所以人们已经开始进行一系列新的尝试,除了新的佐剂、基于全新原理的递送系统或疫苗接种途径,更重要的则是对一些新型疫苗的探索。

1.3.1 弱毒疫苗(减毒活疫苗) 减毒活疫苗(modified-live virus疫苗,MLV疫苗)是指病原体经过理化方法处理改变毒性亚单位导致其毒性减弱,但保留结合亚单位的活性,即保持了抗原性的一类疫苗。MLV的免疫程序需要进行科学定制,虽然目前的研究表明MLV疫苗免疫猪群后攻毒PRRSV没有观察到ADE抗体依赖增强(antibody-dependent enhancement,ADE)效应[5],但依然无法排除出现ADE效应的可能性[6]。MLV疫苗对猪只有很好的保护效果[7],但易造成毒力返强,或与野生毒株发生同源重组出现新的毒株,反而加大了疫病防控的难度。

1.3.2 灭活疫苗 灭活疫苗(inactivated virus疫苗)已经获准在世界部分地区使用,但迄今为止的证据表明,其免疫效力并不能完全满足对PRRS防控的要求,而且由于免疫原性较差[8]导致的需要多次接种的免疫方式给疫病的防控带来了更大的困难。

1.3.3 亚单位疫苗 亚单位疫苗以纯化后的特定病原体蛋白组分构建而成,相比全病原体疫苗,具有可控的安全性和更广泛的使用环境。Taehwan等的研究证明了亚单位疫苗对PRRS有着不错的效果[9]。但是,亚单位疫苗存在着一个显著缺陷,即它的免疫原性通常较低,因此需要使用佐剂并进行重复接种。

1.3.4 载体疫苗 通过保留病毒骨架的同源替换、特异性添加表达元件和转录单元等一系列技术制备的载体疫苗,能够实现人为干预后的高表达量和进入宿主基因组的低重组率[10]。除了以常规载体作为疫苗的装载工具,腺病毒[11]和甲病毒[12]也是疫苗载体的重要研究对象。值得一提的还有Mosaic疫苗,将不同基因型病毒的特定序列拼接以后装至腺病毒上制成的Mosaic疫苗,能够适应大多数具有高度变异性的病毒[13]。

1.3.5 DNA疫苗 DNA疫苗是指编码某种蛋白质抗原的基因重组到真核表达载体后,直接或经包装后导入宿主体内,从而表达外源蛋白抗原,激活机体产生免疫应答,诱导特异性的体液免疫和细胞免疫反应,达到预防和治疗疾病的目的。在目前的研究中,DNA疫苗与亚单位疫苗和载体疫苗相同,虽然已经表现出了良好的发展前景,但都无法完成对猪只的完全保护[14-15]。甚至因其进入宿主细胞核发挥作用,存在着与宿主基因组整合的极大风险[8]。

1.3.6 mRNA疫苗 mRNA疫苗的基本原理是通过特定的递送系统将表达抗原靶标的mRNA导入体内,在体内表达出蛋白并刺激机体产生特异性免疫学反应,从而使机体获得免疫保护。目前,mRNA疫苗还未应用于PRRSV的防控,但多个实验室正在进行相关研究,并已经明确了mRNA作为PRRS防控一大方向的可能性。

1.3.7 6种疫苗应用于猪繁殖与呼吸综合征的可能性 目前,兽医领域存在3种主要类型的疫苗,分别是减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗,它们皆存在安全性或有效性的相关问题,因此,即使减毒活疫苗能够同时引发强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应,而灭活疫苗和亚单位疫苗具有快速研发和良好的稳定性等特点,也无法成为解决PRRSV这种具有极强变异性和传染性的病毒的最终手段[8]。

以腺病毒为主的载体疫苗研究,目前因为中和抗体AdV5的自然感染问题无法解决也一度陷入了僵局[16]。尽管载体疫苗和DNA疫苗可以诱发较强的体液及细胞免疫反应,但两者均存在与宿主基因组整合的风险,载体疫苗还可能发生毒力返强或突变,这对PRRSV疫苗的研发是不利的[8]。

mRNA疫苗不存在传染性,没有毒力返强及整合进入基因组的能力,通常不需要使用佐剂,其引起过高先天免疫原性以及递送困难等问题也已经基本得到解决,再加上能够表达较DNA疫苗更多抗原蛋白的有效性[17]和较短的研发周期,使得mRNA疫苗拥有了完全防控PRRSV的潜能。

在这次的新冠疫情大流行中,mRNA疫苗终于成为了生物医药领域深受关注的研究方向。Sempowski G D等[3]和Mulligan M J[18]等的研究表明,mRNA疫苗不仅以高免疫原性快速引发体液免疫和细胞免疫,且在研发周期与生产成本方面展示出了极大的优势,同时表现出了良好的安全性,为遏制新冠疫情的发展做出了巨大的贡献。这样的事实充分说明了mRNA疫苗极有可能在疫病防控工作中成为一种有效的常规手段。

2 mRNA疫苗

研究者在PRRS防控工作中,就疫苗领域进行了大量的探索和尝试,但不论是传统的灭活疫苗和弱毒疫苗,还是新型的载体疫苗、DNA疫苗等,都难以实现对PRRSV的完全防护[19]。但mRNA疫苗的出现为这一难题提供了可行方案。

mRNA疫苗在人类认识免疫学的前期便有了类似的应用。麻疹、腮腺炎等疫病的疫苗便是mRNA疫苗的早期版本。将不含佐剂的RNA基因组传递到宿主细胞中,受感染的细胞产生病毒蛋白质并对其产生免疫反应,导致炎症反应的发生并诱发一系列免疫进程。体外转录mRNA进入细胞后引发的免疫效应同样如此。

早在1989年,人们就发现被人体吸收的mRNA能够表达出蛋白质,之后也相继出现了一些关于mRNA试验进展的报道。但这些早期的的研究结果并没有引起过多的关注,主要原因在于mRNA的不稳定性、过高的先天免疫原性和过低的体内表达效率[20]。近年来,在mRNA的先天免疫可控性和体内递送方法等领域[20]的重大认识及技术突破[21]和随之而来的资源投入使mRNA疫苗开始成为了极具价值和前景的治疗领域。

2.1 mRNA疫苗的类型

目前作为主要研究对象的mRNA疫苗有两类。

2.1.1 非复制型mRNA疫苗 这类mRNA是在体外转录好的一段含有5′和3′非编码区的完整mRNA,它们只编码特定的抗原蛋白,结构简单且RNA序列简短。但非复制性mRNA在体内的半衰期短,抗原表达量较低,需要较高的剂量才能达到理想的免疫效力。

2.1.2 自扩增型mRNA疫苗 衍生自通过基因工程改造的mRNA病毒基因组,既携带目标的病毒基因组序列,还带有依赖RNA的RNA聚合酶基因[22],不仅能够编码目标抗原,还能实现其在细胞内的自我扩增,大大增强了疫苗效力的持久性,极小剂量就可以诱发有效的免疫应答[20]。与非复制型mRNA疫苗相比,自扩增型mRNA疫苗的转录本更长,并且具有高度的二级结构,这限制了其大规模生产。

2.2 mRNA疫苗的优点

近20年来,mRNA逐渐成为生物领域的研究热点,mRNA疫苗则是其中最具前景的方向之一。以“mRNA三巨头”CureVac、BioNTech和Moderna为主的各大企业及研究所纷纷开启合作,在mRNA疫苗领域展开研究,并取得了一系列成果。最近,世界卫生组织(WHO)承认了mRNA将作为新的治疗方式。

mRNA疫苗拥有着其他类型疫苗难以齐备的优点:(1)安全性:mRNA在细胞内不存在感染及整合进入基因组的潜在风险,并可通过正常的细胞过程降解,其在宿主内的半衰期可以通过各种修饰及递送方法来调节[23]。(2)有效性:多种修饰使mRNA的稳定性和表达量显著提高[24],而将mRNA合成载体分子增加了其被细胞快速摄取及在细胞质中表达的准确性和成功率[23,25]。同时,mRNA 疫苗能够引起有效的体液免疫和细胞免疫[26],带来的免疫原性和免疫效力是极为可观的。(3)高产性:由于体外转录的高产性,mRNA疫苗具有快速、廉价和可行性扩大生产的特点,且研发及生产成本相对较低[27]。(4)便利性:mRNA疫苗的制备只需有关核酸序列的信息,可以极大消除环境、病原体以及疫苗的运输及地区分配等因素带来的风险[27],可在冻干后保留大部分活性[28-30],常温可保存一年,再次溶解后也能够稳定保存长达1周时间[31],便于长时间保存及运输。

3 mRNA疫苗在猪繁殖与呼吸综合征防控中的探索

3.1 mRNA疫苗防控猪繁殖与呼吸综合征的研究现状

遗憾的是,目前未有关于mRNA疫苗实际应用于PRRSV的相关报道,多个从事该项研究的实验室也只是进入了研发的前期。

3.2 mRNA疫苗应用于猪繁殖与呼吸综合征中的趋势及必要性

猪繁殖与呼吸综合征疫情的肆虐极大加速了mRNA疫苗的研发进展,目前已经有了人用mRNA疫苗产品进入市场。在兽用疫苗方面,研究者已经进行过无数尝试,得到了许多有关mRNA疫苗防治有效的结果,但目前仍然只有少数的mRNA疫苗投入兽医领域应用。

PRRSV已经成为了影响全球养猪业的重要病毒。由于PRRSV复杂的基因组结构和极强的变异性,以及其与已经投入市场的弱毒活疫苗之间进行的重组,导致传统疫苗难以对其发挥完全作用。

mRNA疫苗展现了应对与PRRSV一样具有极高变异性病毒的能力。以一项结果为例,以LNP包裹的mRNA疫苗可以诱导保护性记忆CD8+T细胞,并以此对抗致命病毒感染[32]。虽然多数研发才刚刚起步,但mRNA疫苗已经凭借显著的优势成为了防控PRRSV的重要希望。

3.3 mRNA疫苗应用于猪繁殖与呼吸综合征中的可行性及可能方案

安全性、多样的修饰手段、特殊的免疫策略以及多种进入机体细胞的递送方式带来的高免疫效力,使mRNA疫苗拥有着从根本上解决PRRSV的可能性和可行性。

PRRSV的结构蛋白种类较多,它们在病毒的稳定性及侵袭方面发挥着重要的作用,几乎每一种结构蛋白都有着成为mRNA疫苗相应抗原的潜力。GP2a、GP3和GP4形成的三聚体为病毒的内化和脱壳提供支持,但这种三聚体拥有聚糖保护层[2],可以考虑将3种组分分别作为mRNA疫苗承载分子,或为病猪添喂可以降解这种聚糖成分的食物添加剂;GP5是最丰富的糖蛋白,大量已有的研究表明这是一种能够引发中和反应的抗原蛋白[2]。

核衣壳蛋白N蛋白参与了病毒免疫逃避的数种机制,是其免疫原性最强的结构蛋白之一,虽然针对N蛋白的抗体是非中和性且可能诱导抗体依赖增强(ADE)效应,但与GP5、M蛋白结构蛋白串联后共同作为mRNA疫苗的对象分子,依然是极具前景的方案。

除此之外,CD163的SRCR 5受体作为猪细胞感染PRRSV的病毒受体[19],也可以作为mRNA疫苗表达的抗原分子。mRNA进入细胞后,通过表达的抗原分子对宿主原本的SRCR 5受体进行竞争性抑制,阻止或降低PRRSV对猪只的感染。

4 mRNA疫苗免疫活性的增强策略

4.1 一种新的免疫佐剂——TriMix

TriMix是一种编码3种免疫激活蛋白的mRNA的组合,即CD70、CD40配体(CD40L)和组成型活性TLR4。TriMix佐剂至少具有两重优势:(1)几乎不影响抗原mRNA在免疫中的生物利用度;(2)诱导了吸引和刺激T细胞的环境,包括招募抗原特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞[33]。

4.2 mRNA疫苗进入宿主的递送方式

作为疫苗的外源mRNA必须穿透细胞膜屏障到达细胞质才能表达蛋白质。但mRNA分子较大,且表面带负电荷,无法经扩散作用直接通过细胞膜进入细胞。所以递送系统是mRNA疫苗的一个关键要素,它应该协助mRNA通过细胞膜且保护mRNA免受RNA酶的降解作用。目前,基于LNP的递送系统是已经上市和处于研发阶段的mRNA疫苗普遍使用的递送方式[34]。

4.3 mRNA的修饰

4.3.1 mRNA的序列及碱基修饰 对mRNA的序列和碱基进行修饰能够实现至少两方面的优化。

一方面,mRNA的绝大部分信息都包含在序列中,对碱基序列进行的任何改变都有可能引发巨大的效应。mRNA序列中最为核心的编码区域虽然无法如非编码区那样通过延展或缩减进行调控,但可以对编码同种蛋白质的多种密码子进行选择,用丰度更高的密码子替换使用频率较低的稀有密码子,以此提高mRNA的蛋白表达量。当然,稀有密码子的并入致使翻译速度减慢对于某些蛋白质的折叠是必要的,所以改变碱基频率的策略需要慎重[35]。

另一方面,哺乳动物的先天免疫系统含有能够识别mRNA的受体,单链mRNA分子在被载体递送进入细胞时,其本身就是一种病原体相关分子模型(PAMP),会被体内的TLR 7和TLR 8当作抗原检测出来[36],从而带来一些不利于mRNA发挥免疫效能的消极影响。幸运的是研究者发现对mRNA核苷酸碱基进行修饰,例如以假尿苷、1-甲基假尿苷等代替尿苷,能够实现降低先天免疫效应、促进mRNA的翻译等一系列设想[37]。

4.3.2 mRNA的结构修饰 mRNA是一种非常脆弱的生物分子,极易在环境中自发断裂或受到RNA酶的裂解。mRNA侧翼的5′和3′ UTR元件并不作为模板参与蛋白质的翻译,但它们的存在大大增加了mRNA的稳定性和翻译效率[20]。

5′帽结构能够促进mRNA高效表达蛋白质。5′帽的添加可以通过牛痘病毒封顶酶引导的转录后酶促反应或通过掺入合成帽或抗逆转类似物的共转录反应来实现[7]。

3′端的poly(A)尾结构同样发挥重要的调节作用,需要从编码DNA模板入手或直接为mRNA添加最佳长度的poly(A)[38]。

5 总结

mRNA疫苗作为兽用疫苗发展的趋势之一,已经展示出了极强的功能和潜力。而mRNA疫苗在PRRS的防控中可以预想的防控方案和根除可能性为全球养猪业的发展带来了极大的希望,其研发的较短周期和灵活性足以应对PRRSV的田间重组和变异。总的来说,mRNA疫苗为PRRS的防控工作提供了一条理想道路,是值得不断探索并能够最终实现的。