土拉弗朗西斯菌致病机制研究进展

董译滟,王 聪,任晨洋,文雪霞*,张 莹*

(1.沈阳农业大学动物科学与医学学院/东北畜禽疫病研究教育部重点实验室,辽宁沈阳 110866;2.中牧实业股份有限公司,北京 100070)

土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis,Ft)是一种可引起急性、热性、高度接触性人畜共患病病原。该病原于1911年在美国加利福尼亚州图莱里县首次分离,可感染包括哺乳动物、原生动物、两栖动物、爬行动物、鸟类及鱼类在内的至少300种动物[1]。Ft是一种革兰氏阴性需氧菌,具有多形性,无芽孢、鞭毛,营胞内寄生。Ft易于传播、宿主范围广泛、感染剂量低、且能够诱发致命疾病,这些特性使其成为潜在的生物战病原体[2]。根据致病力与地理分布,Ft可分为4个亚种,即土拉亚种(F.tularensistularensis)、全北美区亚种(F.tularensisholarctica)、新杀手亚种(F.tularensisnovicida)和中亚亚种(F.tularensismediasiatica)[3]。土拉亚种(A型)致病性最强,通过呼吸道或皮肤途径感染10～50个细菌即可引起严重疾病。A型又可进一步分为A1a、A1b和A2共3种亚型,在小鼠感染模型中,A1b亚型毒力最强[4]。目前,尚未发现该菌可分泌外毒素,其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)也不具有内毒素活性[5]。因此,毒素并非该菌的毒力因子。已有的研究表明,Ft毒力与其从吞噬小体中逃逸并在宿主细胞质中复制的能力密切相关,且受到许多因素如分子信号传导,基因转录、翻译和翻译后修饰等的影响。Ft最重要的毒力因子包括荚膜、LPS、外膜囊泡(out membrane vehicle,OMV)和分泌系统,尤其是由毒力岛(Francisellapathogenicity island,FPI)编码的Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ secretion system,T6SS)。本文主要就Ft被细胞摄取、从吞噬小体中逃逸、对宿主氧化防御的拮抗、对先天性免疫的抑制等方面对Ft的致病机制研究进展进行综述。

1 摄取机制

Ft可感染多种类型细胞,如巨噬细胞、树突状细胞等吞噬细胞,肝细胞、肺泡Ⅱ型细胞等组织细胞,但主要靶细胞为巨噬细胞。在早期的摄取阶段,Ft凭借自身的Ⅳ型菌毛黏附在宿主细胞表面[6],并分泌许多形状非典型的纳米管状OMV,其中含有许多毒力因子和抗原如脂肪酶FtlA(Francisellatularsislipase A)有利于OMV附着在宿主细胞膜[7-8]。

黏附于细胞表面之后,Ft在受体的介导下进入细胞。巨噬细胞上的甘露糖受体(mannose receptor,MR)、C型凝集素受体、补体受体(complement receptors,CR)3/4,树突状细胞上的CR3/4,中性粒细胞上的CR1/3,B细胞上的CR1/2、B细胞受体以及清道夫受体A(scavenger receptor A,SRA)、Fc-γ受体均参与Ft的摄取与内化过程[9-10]。介导细胞摄取Ft的主要受体取决于细菌是否经过血清或抗体调理。未经调理的Ft,巨噬细胞主要通过MR摄取;调理后的细菌则依靠CR3、SRA与Fc-γ受体摄取[11]。IgM识别Ft的荚膜与LPS上的O抗原后可通过C1q启动经典补体激活途径,促进C3对Ft的调理和之后的吞噬[10]。相反,在无C3的人血清中,巨噬细胞对Ft Schu S4菌株的摄取显著减少。但是,在无C1q的人血清中,巨噬细胞对Schu S4株的摄取与正常人血清并无差异,提示补体激活旁路途径在该过程中也发挥了作用[12]。

2 吞噬小体逃逸机制

巨噬细胞摄取的细菌进入吞噬小体,随后在吞噬小体与溶酶体融合形成的吞噬溶酶体中被降解。Ft可修饰早期内体抗原1(early endosome antigen-1,EEA-1)、溶酶体相关膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein,LAMP)-1/2/3和Rab5/7,在进入细胞1～4 h内降解吞噬体膜从而进入胞浆[13]。Ft FPI编码的T6SS与其从吞噬小体逃逸密切相关。T6SS分泌的IglC、IglD、IglE、IglI、IglJ蛋白可识别巨噬细胞LAMP-1或LAMP-2并与之结合,从而抑制吞噬小体的功能。此外,IglE还可阻止动力蛋白和微管组织中心介导的宿主细胞内转运,从而抑制Ft向溶酶体运输;IglI、IglJ则可阻止吞噬小体与溶酶体融合。migR、PigR、MglA 是T6SS的转录调节因子,可调控部分毒力蛋白的表达。PdpB、PdpC和PdpD是参与吞噬小体破裂的T6SS效应因子,这些因子的缺失可导致Ft吞噬小体逃逸缺陷[14-17]。

3 拮抗宿主氧化防御机制

当病原微生物入侵时,巨噬细胞的代谢会从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解,三羧酸循环的中间产物转变为活性氧(reactive oxygen species,ROS)或其他抗菌代谢物。因此,线粒体在防御微生物和调节炎症因子等方面发挥重要作用。在感染Schu S4菌株的巨噬细胞中,细菌荚膜通过电子传输链(electron transport chain,ETC)复合物Ⅰ和Ⅱ增强感染细菌的细胞中线粒体的代谢功能,阻止细胞向有氧糖酵解转变,从而抑制细胞凋亡和促炎细胞因子的产生。由于线粒体的免疫功能被抑制,细菌可在胞内大量复制,最终导致细胞胀亡[18]。

宿主的ROS与活性氮(reactive nitrogen species,RNS)在免疫防御中发挥重要作用。Ft可表达超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SODs)、过氧化氢酶(catalase,KatG)、谷胱甘肽过氧化物酶、有机氢过氧化物、烷基过氧化氢还原酶(alkyl-hydroperoxide reductase,AhpC)和MoxR-ATP酶对ROS和RNS进行代谢和中和[19]。硫氧还蛋白TrxA1,膜融合蛋白EmrA1和转录调控因子OxyR、osrR均可调控Ft对氧化应激反应的拮抗。硫氧还蛋白TrxA1调节OxyR的表达[20],进而促进过氧化氢及SODB、KatG和AhpC的分泌[21]。膜融合蛋白EmrA1通过促进SODB和KatG的分泌而有助于抗氧化。osrR 属于AraC/XylS转录调控因子家族,特异性地调控Ft对宿主氧化应激反应的拮抗作用。osrR可通过调节Emr MEP(major facilitator superfamily type Emr multidrug efflux pump)基因、FPI基因及新陈代谢相关基因等的表达从多方面参与拮抗氧化应激反应。由此可见osrR在Ft致病机制中发挥的重要作用[22]。

NADPH氧化酶复合体是宿主氧化防御的关键。该复合体由多种酶组成,可以催化分子氧转化为超氧阴离子。Ft也进化出多种机制来阻断中性粒细胞NADPH氧化酶活性。在血清调理后的摄取过程中,Ft可通过调控膜结合细胞色素b558、降低多种PKC底物如p47Phox的磷酸化水平等抑制NADPH氧化酶复合物的形成。此外,Ft还可抑制NADPH氧化酶功能的发挥,从而阻碍中性粒细胞的活化,降低ROS产生,干扰宿主防御机制[23]。

4 抑制炎症反应的机制

Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一类分布于细胞的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRR),它们主要通过识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)启动先天免疫反应。与其他革兰氏阴性菌相同,Ft细胞壁主要成分为LPS,由锚定在外膜上的类脂A、附着在类脂A上的核心低聚糖和O抗原组成。大多数革兰氏阴性细菌的类脂A包含6个长度为12～14个碳的酰基链及可与TLR-4相互作用的磷酸基团,而Ft类脂A为四酰化不对称的、比正常脂肪酸更长的脂肪酸链(16～18个碳);且其葡萄糖主链上磷酸盐缺失或被半乳糖胺保护。这些差异使脂多糖结合蛋白无法识别Ft的LPS,因此,Ft感染机体后,宿主细胞TLR-4信号通路无法激活[24]。

根据识别PAMPs的结构特征,PRR可分为视黄酸诱导基因Ⅰ样受体(RIG-Ⅰ-like receptor,RLR)、NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)和AIM2(absent in melanoma 2)样受体。Nlrp3(nacht LRR and PYD domains containing protein 3)属于NLR家族,被激活时可与ASC和酶原proaspase-1组装形成炎症小体。研究发现,Ft感染敲除Nlrp3的巨噬细胞诱导产生的磷酸化IκB(Inhibitor of NF-κB)、ERK1/2和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB) 水平显著升高,表明Ft可激活Nlrp3炎症小体,通过调控NF-κB与丝裂原活化蛋白激酶信号通路(mitogen-activated protein kinase,MAPK)来抑制促炎细胞因子的产生[25-26]。Gerard等研究发现Ft基因ybeX编码带有DXD基序的糖基转移酶,可与自身的GdcA (glycosyltransferase domain containing protein A)相互作用,阻断NF-κB激活,并对斑马鱼胚胎发育有协同致死作用[27]。E3连接酶TRAF6和TRAF3复合物调控PRR通路的激活。Ft T6SS可通过抑制K63连接的多聚泛素化,阻碍TRAF6和TRAF3复合物形成,从而同时抑制多个PRR通路如TLR、RLR和胞质DNA信号传递,抑制先天性免疫反应[28]。

巨噬细胞受体CR3可介导Ft感染后对促炎细胞因子产生的抑制。该过程因Ft是否经血清补体C3调理而异。对于C3调理后的菌株,CR3与其结合可抑制早期ERK1/2、p38 MAPK和NF-κB的活性,参与调控吞噬过程中和吞噬后不久的免疫抑制。同时,在C3调理的Schu S4菌株-CR3吞噬过程中,Ras GTP酶激活蛋白活性增加,MAPK/ERK的激活被抑制,导致早期炎症小体激活途径上游的Ras-ERK信号级联减少,从而抑制促炎细胞因子产生[29]。未经C3调理的菌株,感染后促炎细胞因子的产生和MAPK的激活依赖于TLR2信号通路,而CR3介导的信号通路上调了Lyn激酶和Akt的激活以及MKP-1的表达,从而限制了TLR2介导的促炎反应[30]。除此之外,Ft可下调PI3K p85α和AKT通路,拮抗宿主的免疫防御机制[19]。

5 维持自身稳定的机制

宿主不断进化以清除侵入机体内的病原菌,而后者必须保持自身蛋白结构和功能的稳定才能得以存活。Ft编码的二硫键形成蛋白A (disulfide bond formation protein A,DsbA)同时具有氧化还原酶和异构酶活性,能够氧化底物中复杂的二硫键并使其异构化,从而修复受损的蛋白,是该菌毒力的重要组成部分。Hoang等发现DsbA的底物多达50余种,包括外膜蛋白、毒力因子等[31]。Ivona等通过分析缺失DsbA菌株蛋白的变化,发现gapA基因编码的甘油醛-3-磷酸脱氢酶属于DsbA底物。该蛋白存在于胞浆、细胞表面与细胞外,除了在糖酵解中发挥作用外,还参与DNA的修复过程,影响其他蛋白的亚细胞分布,结合如纤溶酶原、纤维蛋白原和纤维连接蛋白等胞外血清蛋白[32-33]。细菌细胞壁可维持细胞的形态、结构和膜的完整性,主要由肽聚糖(peptidoglycan,PG)组成。细胞内的革兰氏阴性菌通过回收和修复受损的PG来保护自己免受巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤。研究发现Ft编码的PG循环酶L,D-羧肽酶A(L,D-carboxypeptidase A,LdcA)也是DsbA的底物。该酶亦具有L,D-内肽酶活性,可将PG四肽或五肽转化为三肽,对细菌维持形态和膜完整性至关重要[34]。DsbA的另一底物D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶在维持膜完整性和细胞形态方面也发挥作用,该蛋白可提高Ft对低pH、高温和高渗透压的耐受[35]。

除了DsbA的作用外,Ft还可通过编码蛋白或者释放含有不同蛋白的OMV维持自身稳定,提高对环境的适应性[36-37]。如可溶性的溶菌糖基转移酶,是新凶手亚种在低pH条件下正常生长和细胞分裂的必需因子,该蛋白的缺失会导致其在巨噬细胞中的复制减少[36]。在42 ℃和低pH条件下,Ft的OMV形成率增加数倍,其内的蛋白质组分含量也发生显著变化,且包含与细胞内运输有关的毒力因子[37]。

6 展望

自Ft首次被报道至今,已有一个多世纪。经过不断研究,对该病原生物学特性和与宿主相互作用的机制等的理解也逐渐深入。尽管如此,人们仍未完全阐释Ft的致病机理和免疫逃逸机制。Ft感染后在宿主细胞尤其是巨噬细胞内的生存和增殖是其生命周期中的核心,也是感染后引起宿主发病的关键。这涉及到一系列生物学过程,包括对先天性免疫的抑制、被巨噬细胞摄取、从吞噬小体中逃逸、对宿主氧化防御的拮抗、胞浆内的增殖等。这些过程的变化均有可能引起Ft特性的改变甚至毒力的减弱。因此,对这些科学问题的进一步探究和阐释至关重要,将为疫苗、药物或者新疗法的研制提供靶点。