鸡斑点肝病的研究进展

王建琳,尹燕博

(青岛农业大学动物医学院,山东青岛 266109)

鸡斑点肝病(Spotty liver disease,SLD)也称为鸡斑点肝脏综合征(Spotty liver syndrome),是一种以产蛋量降低、急性死亡和肝脏出现灰白色坏死点为特征的鸡的重要传染病。该病通常发生于散养蛋鸡及垫料饲养的肉种鸡[1],偶尔出现于笼养蛋鸡[2]。该病严重影响患鸡的生产性能,导致鸡群产蛋量急剧下降10%～35%,累计病死率高达11%～30%[1,3],严重影响养鸡业健康发展。

1 鸡斑点肝病发生情况

20世纪50年代,美国首次报道了SLD,随后加拿大、新西兰、爱沙尼亚、英国、奥地利、德国、澳大利亚、埃及、匈牙利、法国、约旦和意大利等国也报道了类似疾病,被认为是困扰全球家禽养殖业的重要疾病[3]。根据肝脏病变特征,该病曾被称为粟粒性肝炎、夏季肝炎、禽传染性肝炎、急性局灶性肝炎和禽弧菌性肝炎[2]。北美家禽感染禽弧菌性肝炎的报道一直持续到20世纪60年代,然后有所下降;从20世纪80年代中期开始,该病在英国的蛋鸡群中持续发生[2]。在过去的60年里,该病在多个国家零星报道,而近年来在澳大利亚的发病率急剧增加,由于其高病死率和明显降低产蛋量成为目前严重影响澳大利亚家禽养殖业的重要疾病[3-5]。随着SLD不断在其他国家和地区的出现,该病可能成为全球蛋鸡产业的国际性问题[6-8]。

2 鸡斑点肝病的病因

SLD最初在美国和加拿大发现时,一种类似弧菌(‘vibroid’ bacterium)的生物体被怀疑是该病的病因,故被称为禽弧菌性肝炎(Avian vibrionic hepatitis,AVH)[9];病原感染鸡胚和雏鸟后,尽管出现了死亡,但没有复制出临床病例出现的典型肝脏病变[10]。在后来的追溯性分析,认为多种细菌,如弧菌样细菌(Vibrio-like bacteria)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、大肠弯曲菌(Campylobactercoli)、白痢螺杆菌(Helicobacterpullorum)等可能与该病有关,但却都没能通过动物感染试验来证明这些细菌是引起SLD的病原[2,10-13],故SLD的病原多年来一直未被确定。

直到2015年,英国的Crawshaw T等[14]从SLD症状鸡体内分离到一种新的嗜热、微氧弯曲菌;2016年澳大利亚的Van T等[15]从SLD病例中分离的细菌被鉴定为肝弯曲菌(Campylobacterhepaticus),并于2017年进行的动物回归试验,将分离的家禽肝弯曲菌感染蛋鸡,被感染鸡出现与临床自然感染鸡相似症状,从而肝弯曲菌被确定为SLD的病原[16]。之后,肝弯曲菌引起的SLD在英国、美国、约旦和新西兰等被多次研究所证实[6-7,17-19]。最近,研究报道从澳大利亚几个农场SLD患鸡中分离出一种新的弯曲菌,即胆汁弯曲菌(Campylobacterbilis),该细菌是在常规肝弯曲菌分离过程中分离获得,应用肝弯曲菌PCR检测引物检测为阳性。在随后的全基因序列测序分析过程中发现,该分离株与先前鉴定的肝弯曲菌并不处于同一分支,同源性较低,故被列为新的种类[20];动物感染试验表明,胆汁弯曲菌感染26周龄蛋鸡后部分鸡出现眼观典型的肝脏坏死现象,部分鸡并未出现,但可从未出现眼观症状鸡的胆汁中分离到细菌,认为胆汁弯曲菌是引起SLD的第二类细菌[19]。研究报道肝弯曲菌也可从胆汁中分离,这一新型胆汁弯曲菌和肝弯曲菌在致鸡SLD的分子机制尚未见报道,二者的详细关系也不明确,胆汁弯曲菌是否可独立作为SLD的第二类细菌等,这些都有待于后续更多的研究证实。

据报道,在英格兰、爱尔兰和澳大利亚等国家,及时适量使用抗菌药物可减轻鸡群的损伤,但产蛋量没有任何改善[2]。这一临床治疗现象不得不引发思考,SLD是否是单纯细菌感染引起。2022年,Subir S等[3]对自由饲养患SLD的蛋鸡胆汁进行病毒组学研究,检测到15种鸡形目病毒(Chaphamaparvoviruses,GaChPVs),表明澳大利亚鸡群中流行着多种细小病毒,推测认为鸡SLD可能由多种病原体感染引起,而这些病毒与SLD的关系有待于进一步证实。

尽管一些研究表明,临床出现的应激等其他诱因的存在,更易于肝弯曲菌感染引起SLD的发生,但到目前为止,肝弯曲菌是唯一被确认为可引起蛋鸡SLD的病原[8]。

3 肝弯曲菌的特性

肝弯曲菌属于弯曲菌目、弯曲菌科、弯曲菌属(Campylobacter)。肝弯曲菌是一种革兰氏阴性S型细菌,在微氧条件下生长。它有单极性鞭毛,长度在1～1.2 μm之间,宽度在0.3～0.4 μm之间[4],与其他弯曲菌种类相比,肝弯曲菌的基因组很小,约1.5 Mb,G+C含量较低,不同菌株其基因组的同源性在27.9%～28.5%之间[12]。通常不能发酵或氧化碳水化合物,因此能量主要来源于氨基酸或三羧酸循环中间体的降解[21]。由于缺乏完全选择性的培养基,及其他污染微生物的快速生长,导致从临床病料中分离肝弯曲菌非常困难[22]。肝弯曲菌保存在水或简单的盐溶液中进入可存活不可培养状态(viable but nonculturable,VBNC),利于其在恶劣环境条件下延长生存期,但很难在初次分离培养基上生长,需对培养基进行调整利于其复苏[23]。

肝弯曲菌可在鸡胆汁中生存,胆汁是一个具有挑战性的环境,因此推测肝弯曲菌具有特殊基因的表达,以确保它们在这个生态环境中生存;通过基因组序列分析发现肝弯曲菌编码葡萄糖和多羟基丁酸盐代谢通路,表明肝弯曲菌代谢具有可塑性,这可能有助于其在竞争、营养和能量有限的环境中生存[12]。通常情况下,弯曲菌属属于非水解糖酵解菌,与空肠弯曲菌相比,其编码的与碳水化合物利用途径相关基因较多,这可能有助于肝弯曲菌在类似肝脏等这种富含碳水化合物的环境中生存[24]。

肝弯曲菌与食源性致病性空肠弯曲菌和大肠弯曲菌关系最为密切,空肠弯曲菌和大肠弯曲菌在鸡体内大多是常在菌,而对人具有致病性;不同的是肝弯曲菌可引起鸡的SLD,但对人类和其他动物的致病性尚未见报道[25]。通过基因组序列比较分析发现,与其他细菌的定植和感染所需要的许多基因相似,肝弯曲菌有大量与趋化性(11个基因)、运动性(47个基因)和黏附性/抗原递呈 (45个基因)相关的基因[26]。肝弯曲菌编码弯曲菌入侵抗原(CiaB) ,在侵染鸡上皮细胞中发挥重要作用,该蛋白可能通过鞭毛输出装置分泌;有研究报道,空肠弯曲菌的CiaB可传递到宿主细胞的细胞质,从而刺激宿主细胞信号传递并促进细菌内化[27];该基因的突变可降低细菌的毒力[28]。肝弯曲菌也编码一组参与假氨基酸生物合成(pseudaminic acid biosynthesis,Pse)的基因;幽门螺杆菌和空肠弯曲菌的结构性鞭毛蛋白被Pse糖基化,这种糖基化是鞭毛组装和随后的运动所必需的,因此Pse被认为也是一个关键的毒力因子[26]。

肝弯曲菌可从患病鸡肝脏、胆汁、小肠和盲肠中分离到[14]。肝弯曲菌感染蛋鸡出现SLD特征性症状,与其编码的独特基因有关。推测认为肝弯曲菌具有其独特的致病基因,即细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT)基因,编码导致肝脏损伤、高死亡率和产蛋量降低的产物。通过基因组关联性分析结果表明,肝弯曲菌编码基因在趋化、荚膜的形成和低脂糖合成和代谢中发挥着作用;转录组分析表明,与葡萄糖利用、应激反应、氢代谢和唾液酸修饰相关的基因簇可能在肝弯曲菌的致病性和适应特殊生长环境中发挥重要作用[21]。有关肝弯曲菌毒力基因及与其致病特征相关基因还有待于进一步研究。

4 鸡斑点肝病的流行特点

大多数SLD发生于22～35周龄的产蛋母鸡,尤其是26～27周龄的产蛋高峰期母鸡极易发生。研究认为患鸡发病前8周可能感染肝弯曲菌,最早感染日龄为12周龄[22]。基于养殖场的研究表明,从环境到鸡舍的水平传播是养殖场弯曲菌最常见的传播途径。潜在的感染源包括垃圾、未经处理的饮用水、其他农场动物(如猪、牛、羊等)、家养宠物、野生动物(尤其是野鸟)、家蝇、昆虫、黑甲虫、蟑螂、设备和运输车辆、养殖场工人等。关于弯曲菌是否通过垂直传播而导致疾病的发生,目前还存在争议。大部分的研究认为,弯曲菌不会在家禽通过垂直传播,因为没有2或3周龄前雏鸡感染弯曲菌的研究报道,且很少有报道从鸡蛋和鸡胚中分离到弯曲菌[21]。

5 鸡斑点肝病的临床症状及病理变化

SLD鸡只死亡速度极快,死亡鸡只身体状况良好,推测认为急性败血症/毒血症是死亡的主要原因[14]。目前,SLD的主要病变特征为肝脏表面有大量的小的、白灰色的坏死点,这些坏死点有时呈现黄色或红色的,而且看起来并不凸起的或下陷于肝脏表面[14]。部分患鸡可能出现纤维素性肝周炎,同时腹腔和/或心包腔内有大量的清亮液体;有时患鸡出现黄疸和肝脾肿大现象,腹部脂肪和心冠脂肪偶有点状出血[2]。

显微镜下可见肝脏有多灶性细胞坏死,坏死区域有纤维蛋白沉积,有时伴随着出血和不同程度的异嗜性粒细胞等炎性细胞浸润[14]。有些病例可见肝脏发生凝固性坏死,周围无明显炎性细胞浸润,偶见脾脏发生坏死,而未见明显胆汁淤积[2]。有的病例可见胆管上皮增生,上皮间可见少量淋巴细胞浸润,胆管周围有浆细胞浸润[6]。研究报道肝脏坏死区域分离不到细菌,肝弯曲菌通常在感染鸡的肠道中定植,从十二指肠到回肠数量增加,盲肠内数量最多;它们也很容易在泄殖腔拭子中被检测到,这表明该病很可能通过粪-口途径传播[15]。

6 鸡斑点肝病的诊断与防治

6.1 鸡斑点肝病的诊断

SLD是以患鸡肝脏的病变特征命名,临床应与出现相似病变特征的疾病进行区分。沙门氏菌感染后患鸡肝脏明显肿大,通常有针尖大的白色到红色出血性坏死灶,白色坏死灶往往聚集性存在,通常肝脏和心脏表面覆盖有纤维素性渗出;急性巴氏杆菌感染患鸡肝脏肿胀,通常含有多个小的凝固性坏死灶;Ⅰ群禽腺病毒感染后,肝脏苍白、脆弱、肿胀,可见小的白色病灶,可见点状或淤斑性出血;戊型肝炎病毒感染后,肝脏通常肿大,出现局灶性、灰色、有时凹陷的病灶,直径可达数毫米,随机分布在肝脏各处,大致呈圆形、椭圆形或椭圆形[29]。SLD的诊断通常是结合临床特征性病变,进行实验室病原微生物的分离与鉴定,并从感染组织部位通过分子生物学技术进行病原检测,或通过血清学诊断进行确诊。

弯曲菌对生长条件要求较高且生长缓慢,需要微氧环境(含5% O2,10% CO2,85% N2)和较高的生长温度(37～42 ℃),在低于31 ℃的温度下观察不到生长。因此,从粪便中培养弯曲菌属需要有选择性的培养基和特殊的培养条件。在琼脂平板上形成肝弯曲菌落所需的孵育时间从3～7 d不等,这取决于培养的菌株[6,14]。由于弯曲菌对高于5%的氧水平敏感,弯曲菌选择性培养基通常含有各种氧猝灭剂,以中和氧自由基的毒性作用。常用的氧猝灭剂包括血液、硫酸亚铁、焦亚硫酸钠和丙酮酸钠的组合、木炭和血红素。

分子生物学技术,特别是聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),已被用于直接检测各种来源的弯曲菌,但其主要用途是确认/鉴定分离的弯曲菌。越来越多的基于DNA的方法已被开发用于分离弯曲菌的分子分型,如脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)、随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、比较基因组指纹图谱(comparative genomic fingerprinting,CGF)等方法[21]。为有效区分3种弯曲菌,即大肠弯曲菌、空肠弯曲菌和肝弯曲菌,研究报道基于肝弯曲菌hsp60基因设计特异性引物,通过PCR和高分辨率熔融曲线(high-resolution melting, HRM)分析可检测和区分3种弯曲菌[30];也有研究报道,通过检测不同的基因(hipO基因,GlyA基因和GK基因)建立多重PCR以区分3种细菌[31]。

研究报道有关肝弯曲菌的血清学诊断方法主要有酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。以肝弯曲菌总蛋白提取物作为抗原包被在ELISA试验板上,用空肠弯曲菌提取物进行预吸收血清,以消除肝弯曲菌与空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的交叉反应性,该方法优化后其特异性为95.5% ,敏感性为97.6%[32]。此后,结合生物信息学分析和液相色谱-质谱联用蛋白质分析,鉴定了具有肝弯曲菌特异性抗原性的蛋白-丝状血凝素黏附素(filamentous hemagglutinin adhesin,FHA),其FHA1 628-1 899片段可用于该菌血清学诊断;利用重组 FHA1 628-1 899作为抗原,在ELISA板上可捕获感染鸡血清中的特异性抗体。与上述总细菌蛋白提取物建立的ELISA相比,该方法更易于操作和标准化[33]。基于肝弯曲菌建立的ELISA方法,可用于SLD的诊断,也可为疫苗的研发奠定基础。

6.2 鸡斑点肝病的防治

到目前为止,仍然没有商业用疫苗可有效预防本病的发生。有研究报道,盐酸金霉素、林可霉素和奇霉素联合阿莫西林、提木林和红霉素等可用于SLD的治疗[2]。虽然使用抗菌药物治疗是控制细菌性疾病暴发的最有效手段,但它不能防止该病的暴发。也有研究尝试通过管理来预防或最小化SLD的影响,如安装风扇、铺泥土地面、全面消毒等[2]。有研究报道饲料中添加异喹啉类生物碱(isoquinoline alkaloids,IQA)可明显降低肝弯曲菌感染鸡肝脏表面的粟粒病变数量,减轻肝脏病变;未对肠绒毛高度和隐窝深度产生显著的变化,但导致血液中促炎性细胞因子白介素-8的显著减少;微生物区系分析表明,IQA处理没有改变盲肠微生物区系的α多样性,但确实产生了系统发育结构的变化[34]。有研究报道饲料中添加20 g/kg生物炭可影响鸡体内的微生物菌群组成,对肝弯曲菌的含量有明显抑制作用[35]。尽管饲料添加剂对改善SLD有一些益处,抗菌药物治疗是控制SLD直接的方法,但疫苗SLD是更可持续的非抗菌药物控制方法。

SLD在很多国家和地区发生,而我国还未见系统研究报道。曾报道临床有鸡弧菌性肝炎的发生,也提及鸡弧菌性肝炎是由空肠弯曲菌感染引起,但未对病原进行详细研究,也未对分离鉴定的细菌进行实验室动物感染试验。20世纪50年代和60年代期间,北美曾报道蛋鸡中流行弧菌性肝炎,有人曾怀疑弯曲菌是弧菌肝炎的病原,但对于弧菌肝炎的病原体到目前为止还没有正式确定[36]。

临床上鸡肝脏损伤的病例较多,病原明确的,包括沙门氏菌感染、禽腺病毒感染、戊肝病毒感染等,也有部分原因不确定的或较为复杂的。是否SLD与其他传染性肝炎混合感染,由于其他病原的检出而影响SLD病原的进一步检测,值得探究。鉴于临床上产蛋鸡肝脏损伤发生较多且部分原因不明,及其对养鸡业的经济影响,SLD需要引起养鸡业足够的重视,应该尽快进行病原检测、预防和治疗等方面的技术和产品储备。目前,还未检索到国内外商品肉仔鸡发生SLD的报道,但禽病学(第十四版)中提及尽管发生很少,但在笼养蛋鸡和肉鸡中也观察到该病[36]。所以我们认为,肉鸡行业也应该关注这一问题。