畜禽粪便中抗菌药物降解方法及残留检测技术研究进展

赵梓筱,苏 薇,闫金坤,柳焕章,刘孟啸,刘建钗*

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院,河北邯郸 056038;2.河北工程技术学院城乡规划系,河北石家庄 050000;3.河北工程大学园林与生态工程学院,河北邯郸 056038)

畜牧业是我国农业农村经济发展的重要产业,伴随着畜牧业的发展,大量的养殖粪污也带来了巨大的环境问题。我国是世界上最大的养殖粪污产生国,每年产生畜禽粪污约38亿t[1],由于动物粪便的有机养分含量高,被广泛应用于天然肥料来增加粮食产量。然而,粪便中的抗菌药物残留会造成水环境和土壤环境的污染,环境中的抗菌药物会诱导抗性基因的产生,对人类以及生态环境带来了巨大的威胁[2]。因此,加快畜禽粪便无害化处理和资源化利用对我国畜牧业的可持续发展具有重要意义。

1 抗菌药物的污染概况

随着集约化养殖的大力发展,兽用抗菌药物的用量也在不断增加。畜禽摄入的抗菌药物约有60%～90%以原型或代谢物的形式随尿液、粪便排出[3]。据统计,全球每年生产约10万t抗菌药物,其中近三分之二用于畜牧业[4]。我国是世界上最大的抗菌药物生产国和消费国,抗菌药物每年的生产量高达21万t,使用量达18.9万t,兽用抗菌药物占使用量的一半以上[5]。2013年,我国磺胺类的使用量达到了7 920 t,用于兽药的占76%,用于医药的占11%[6]。任君焘等[7]对山东东营地区畜禽粪便残留抗菌药物进行了调查,在猪粪、鸡粪、牛粪中磺胺类抗菌药物检出率为6%～100%,氟喹诺酮类检出率为62%～100%,四环素类检出率为98%～100%,大环内酯类检出率0～50%,猪粪中四类抗菌药物含量最高,鸡粪次之,牛粪中最低。周倩[8]通过对天津不同规模猪场粪便中抗菌药物的检测发现,所检样品中四环素类抗生素浓度达1 260.42 mg/kg,含量最高的单体抗菌药物为土霉素。阮蓉[9]对天津市蓟州区家庭养殖环境中兽用抗菌药物残留情况研究发现,猪粪中抗菌药物残留最高,牛粪次之,鸡粪最低。Manuel C C等[10]对畜禽粪便中抗菌药物残留情况的检测结果显示,猪粪中强力霉素的残留量高达106.0 mg/kg。Pan X等[11]报道,在中国山东21家动物饲养企业收集的126份猪粪样品中,四环素类、磺胺类和大环内酯类的检出率分别为85%～97%、52%和5%。因此,畜禽粪便在利用之前应采取有效的措施来降解其中抗菌药物及耐药基因对环境和动物及人类的影响。

2 粪便中抗菌药物降解的方法

2.1 微生物强化堆肥法

堆肥法是使畜禽粪便无害化、资源化的一种有效手段,长久以来在国内外广泛地被研究和应用。粪污堆肥处理是在人为控制温度、湿度、碳氮比、通风条件等的基础条件上,依靠自然界和畜禽粪便本身所存在的各种细菌、真菌等微生物在高温发酵状态下,使粪便中的大分子有机质变为小分子的有机物[12]。微生物强化堆肥是通过向堆肥系统中加入特定的微生物,提高有效微生物的浓度,增强难降解有机物的降解能力,提高其降解速率。

Youngquist C P等[13]通过对实验室和农场规模的堆肥系统中16种抗菌药物的研究,结果表明,在所有情况下,堆肥都可以显著降低畜禽粪便中的抗菌药物的残留。肖文敏[14]试验表明,在低温环境条件下,添加微生物菌剂的猪粪堆肥处理组中抗菌药物的去除率明显优于未接种微生物菌剂的对照组。张学虎等[15]试验证明,在羊粪堆肥发酵中添加复合微生物菌剂的效果优于自然状态下的处理结果。陈文俊等[16]研究发现,蛋鸡粪堆肥以稻草为调理剂并添加2.5%微生物制剂能够影响细菌多样性并有效提高碳源利用。Liu Y等[17]研究发现,通过向堆肥猪粪中添加以黄孢原毛平革菌、黑曲霉和地衣芽孢杆菌为主的不同接菌剂能够去除猪粪中多种抗菌药物和抗性基因。

在微生物强化堆肥过程中的温度、时间、碳氮比等都可以影响抗菌药物的降解速率。Yu Y等[18]在探究温度对畜禽粪便中四环素残留发现,四环素在70 ℃时降解的半衰期为1.66 ～7.62 h,60 ℃时为3.29～21.39 h,50 ℃为9.25～57.19 h,与对照组相比,堆肥过程中适当升高温度可以提高抗菌药物的降解效率。堆肥处理中抗菌药物的时间也随抗菌药物的种类有很大的差距。由于微生物对抗菌药物消减的高效、环保和操作简单等优点,微生物降解已成为处理抗菌药物污染的有效途径。应用微生物堆肥处理技术能够较彻底,可针对性的降解特定抗菌药物,且对环境不易产生二次污染,此方法将畜牧养殖和农业种植有效结合,减轻畜牧养殖对周边生态环境造成的污染和破坏,实现能量资源的高效循环利用。

2.2 光降解法

光降解通常指吸收光子而导致有机物的分解反应。光降解反应机理主要在于分子吸收光能变成激发态从而发生各种反应。光降解主要包括直接光解和间接光解[19]。直接光解是抗菌药物直接吸收光能,使得抗菌药物分子由基态转化为激发态,在激发的状态下改变其分子结构。而间接光解是在抗菌药物降解体系中加入光敏物质,这种物种在吸收光能后转为激发态,光敏物质在激发态将能量传给抗菌药物,使得抗菌药物分子结构发生改变。季秋洁[19]试验证明,在光照条件下的猪粪堆肥中,3种氟喹诺酮类抗菌药物的降解较快,而避光条件下几乎不降解。

影响抗菌药物光降解的因素有很多,例如光照、pH、腐殖酸和金属等都可以影响其降解程度。孟庆玲等[20]研究了太阳光、氙灯、汞灯对3种头孢类抗菌药物的光降解。结果表明,3种头孢类抗菌药物在3种光源照射下均能发生直接光降解,但汞灯的降解速率最高。Razuc M等[21]研究发现,当环丙沙星浓度为60 mg/L时,环丙沙星在pH为5、7、9的光降解符合一级降解动力学。

2.3 厌氧消化法

厌氧消化因其能产生沼气,故又称为沼气发酵,指在没有溶解氧、硝酸盐和硫酸盐的条件下,通过微生物生长代谢各种有机质进行分解并转化为CH4、CO2、微生物细胞以及无机营养物质等的过程[22]。厌氧消化技术是畜禽粪便资源化、减量化、无害化的主要生物处理技术之一,其不仅可以有效解决粪污污染,还可以产生清洁的可再生能源,发酵后的沼液、沼渣也可代替化肥施于土壤中,对生态环境有着积极作用。靳红梅等[23]采用批次室内模拟发酵试验法对猪粪中磺胺嘧啶(SDZ)和磺胺二甲嘧啶(SM2)在中温(37 ℃±1 ℃)厌氧消化条件下的吸附和降解特征进行研究,结果显示,SDZ和SM2的去除符合一级动力学模型,去除率分别为58.7%和74.0%,降解半衰期分别为5.85 d和5.90 d。

温度、pH、有机质的含量、水分、金属等都可以影响厌氧消化对抗菌药物的降解。Massé D I等[24]研究发现,土霉素在5 ℃和15 ℃的厌氧消化中去除率几乎相同,在25 ℃时,其去除率提高了20%。杨侠等[25]探究pH对污泥厌氧消化过程中抗菌药物降解试验表明,pH为7.5时,总抗菌药物去除率最高,为55.7%;pH为5.5时,总抗菌药物去除率最低,仅为21.7%。厌氧消化法除了可以降低动物粪便中抗菌药物的浓度外,还可以产生甲烷,但该方法不能完全去除粪便中四环素类药物[22]。因此,采用该方法降低粪便中抗菌药物也存在一定的局限性。

2.4 植物修复法

植物修复是利用绿色植物的吸收、挥发、根滤、降解、稳定等作用来富集或分解污染物,以达到清除污染物、修复和治理的目的[26],该技术具有修复范围广、成本低、不引起二次污染、增加被修复土壤的有机质浓度等特点。章程[27]试验表明,植物对抗菌药物具有降解能力,但降解的效果与植物的种类与其生长环境是有关的。植物修复法对养殖场废水中的抗菌药物去除有良好的效果,但对畜禽粪便在固体状态下的抗菌药物去除效果不显著。

3 粪便中抗菌药物残留的检测

3.1 高效液相色谱法

畜禽粪便中抗菌药物残留量一般比较高,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)具有分析速度快、分离能力强、灵敏度高等特点,都满足检测的需要[3]。粪便检测方法中高效液相色谱法比较合适,常用的检测器有紫外检测器(ultraviolet absorption detector,UVD)、二级阵列检测器(diode array detector,DAD)、荧光检测器(fluorescence detector,FD)等。DAD和UVD主要用于检测含有紫外吸收基团的兽药,具有灵敏度高、低噪声、线性范围宽等特点。FD具有高灵敏度和选择性的检测器,只能检测具有荧光性的兽药,对待测分析物具有选择性。

姚倩等[28]利用HPLC-UVD测定了海南省不同地区典型养殖场鸡粪便中四环素和大环内酯类抗菌药物的含量及其分布特征。结果表明,四环素类总含量在0～2 839.3 μg/kg之间,以金霉素为主;而大环内酯类总含量在0～845.2 μg/kg之间,以北里霉素为主。Yao F等[29]建立了猪、鸡以及牛粪便中磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑的HPLC法,方法的回收率达62.65%～99.16%,检出限为0.1～1.9 μg/kg,定量限为0.3～5.9 μg/kg。李云辉等[30]利用HPLC-FD测定了广州市畜禽粪便中4种喹诺酮类抗菌药物的含量,结果显示,4种喹诺酮类抗菌药物均被检出,以环丙沙星为主。4种喹诺酮类抗菌药物加标回收率在65.8%～121.7%之间,相对标准偏差均低于8.0%,样品定量限为0.46～1.23 μg/kg。

3.2 液相色谱-串联质谱技术

液相色谱-串联质谱技术(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)是通过接口装置将分离性能优异的液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子质量和结构信息的质谱法相结合的现代分离分析技术[31]。此检测方法检测速度快、灵敏度高、重复性好,一次进样可同时分析检测多种兽药及其代谢物残留的准确性定量分析[32]。Pokrant E等[33]用5种不同抗菌剂对肉鸡进行处理后检测肉鸡粪便中抗菌剂的浓度,建立了LC-MS的多残留检测方法。结果表明,土霉素浓度为1 471.41 μg/kg,为整个采样期间的浓度最高;氟苯尼考、泰乐菌素、恩诺沙星和环丙沙星在处理鸡粪的18 d后消失;磺胺氯哒嗪在治疗30 d后逐渐减少。近年来,通常利用LC-MS进行抗菌药物检测,在对水中诺氟沙星等抗菌药物进行检测,每6 min就能完成一个样品的检测,检出限通常为0.3～1.0 ng/L,具有很高的检测效率和灵敏度[34]。Kaddah M M Y等[35]利用LC-MS法对水环境中的16种头孢菌素进行检测,结果发现其回收率在61.69%～167.67%,相对标准偏差为2.45%～13.48%。

3.3 毛细管电泳法

毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)又名高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis,HPCE),是近年来发展的一项新技术,主要是用高压直流电场为动力,以毛细管为分离管道,在毛细管里根据抗菌药物化合物样品中离子的差异所产生的分配差异而实现的一种液相分离技术。此方法操作方便,分离速度快、效率高,应用范围广[36],但由于毛细管的内径一般都小于100 μm,进样体积小、检测光程短,因此检测的灵敏度较低。汪雪雁等[37]以HPCE为检测方法,对4种头孢类药物进行色谱分析,结果显示,4种头孢类药物的回收率为78.00%～83.04%,RSD为2.18%～3.79%。Yang J等[38]采用CE-二极管阵列检测法对硝基咪唑类抗菌药物进行检测,其检出限在16～97 ng/mL之间,相对标准偏差在0.32～0.55之间,加标回收率在87.43%～104.8%之间。

4 小结与展望

近年来,随着集约化畜牧业的发展,兽用抗菌药物的用量仍然很大,在当前无法全面禁止使用抗菌药物的背景下,倡导“减抗”“替抗”的必要性尤为重要,对减少抗菌药物的使用起到了积极的改善作用,畜禽养殖业抗菌药物的使用导致了动物源性食品抗菌药物的残留,长期使用这些食品会对人体健康造成危害,环境中的抗菌药物残留诱导耐药基因的产生也会对土壤、微生物以及人类健康带来潜在风险。目前,迫切需要管理抗菌药物在动物和人类中的使用,这就需要有关部门从源头对抗菌药物进行控制,对养殖业进行科学的用药指导,控制其使用量以及休药期。此外,为有效阻断畜禽粪便中抗菌药物及耐药基因的传播,在使用前要对粪便进行有效的处理。目前,常见的方法是使用微生物强化堆肥来去除粪便中抗菌药物及耐药基因的残留,该方法降解较彻底、对环境不易产生二次污染,也可针对性地降解特定的抗菌药物,减少其向环境中的输入,降低对环境的危害。