促红细胞生成素衍生肽对表柔比星致大鼠心肌损伤ERK1/2信号通路的影响

冯俊月 李跃荣 马宝新

(滨州医学院附属医院，山东 滨州 256600)

阿霉素是一种有效的抗肿瘤药物，但它会导致累积性和剂量依赖性的心脏毒性，范围从心肌结构和功能的隐匿性改变到可能导致心脏移植或死亡的严重心肌病和充血性心力衰竭〔1〕。阿霉素诱导的心脏毒性的确切因果机制仍然不清楚，这使得很难预测或预防其在个别患者中的严重不良事件〔2〕。研究发现〔3〕阿霉素和相关的蒽环类药物表柔比星(EPI)在蛋白和mRNA水平上显著上调了心肌细胞的死亡受体的表达，由此产生自发凋亡。促红细胞生成素(EPO)是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白激素，具有促进造血的功能，还可作为一种保护因子，作用于机体多种组织器官，包括神经系统、心脏 、肾脏等〔4〕，通过减少细胞凋亡、抑制炎症反应、促血管生长等发挥其组织保护作用〔5〕。EPO衍生肽(HBSP)是EPO衍生物，HBSP与EPO具有组织保护作用，但HBSP不刺激骨髓造血系统，无促红细胞生成，避免了EPO导致高血压、高凝等副作用〔6〕。目前研究表明〔7,8〕，HBSP可能是通过caspase-3凋亡相关蛋白发挥抗凋亡作用，通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路改善EPI所致心肌损伤模型大鼠心肌损伤。细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2是一种与心肌保护相关的重要胞外信号调节蛋白激酶，其相关的信号转导途径被认为是经典丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径。然而ERK1/2信号通路是否对EPI所致心肌损伤发挥保护作用需研究证实。本文探讨EPO衍生肽对EPI所致大鼠心肌损伤ERK1/2信号通路影响作用机制。

1 材料和方法

1.1实验材料 雄性Wistar大鼠(济南朋悦实验动物繁育有限公司)；注射用盐酸EPI(海正辉瑞制药有限公司)；注射用重组人促红细胞生成素(rhEPO) (昂德生物药业有限公司)；HBSP(上海科肽生物科技有限公司)；细胞色素(Cyt)C、半胱胺酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；山羊抗兔多克隆二抗、山羊血清(北京中杉金桥生物技术有限公司)。总RAN提取试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)，逆转录试剂盒及实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(TaKaRa公司)；ERK1、ERK2引物及内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；上海生工生物工程有限公司)。

1.2动物造模 雄性Wistar大鼠40只，6～8周龄，体重260～300 g，适应性喂养1 w。随机数字表法分为4组，每组10只，分为正常对照(CON)组、EPI模型组、EPO治疗组、HBSP治疗组。EPI模型组：每周给与腹腔注射EPI(2.5 mg/kg)1次，共6 w，累积剂量15 mg/kg，注射等量生理盐水在给与EPI前1 d，后1 d及后3 d；EPO治疗组：每周给与腹腔注射rhEPO(5 000 IU/kg)3次，分别为注射EPI前1 d，后1 d及后3 d，共6 w；HBSP治疗组：腹腔注射HBSP 60 μg/kg，给药时间同EPO组。CON组以等量生理盐水腹腔注射6 w。再喂养5 w后处死大鼠。

1.3苏木素-伊红(HE)染色 麻醉大鼠，心脏灌流后，固定取心尖组织，多聚甲醛溶液浸泡固定，经脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋。切片厚约4 μm，行HE染色。于光学显微镜下观察大鼠心脏组织。

1.4免疫组织化学测CytC、caspase-9表达的变化 石蜡块切片厚约4 μm，常规脱蜡、脱水。乙二胺四乙酸(EDTA)热修复抗原活性，3%过氧化氢(H2O2)灭活内源性过氧化物酶，5%山羊血清封闭后滴加一抗，CytC、caspase-9 浓度分别为1∶200、1∶50，4℃孵育过夜。加山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。置于光学显微镜下观察心肌组织，每组随机取8张切片，每张切片随机选取5个400倍视野在光镜下进行观察。用Image Pro Plus5.1图像分析软件测定心肌组织中CytC、caspase-9蛋白表达的平均光密度(IOD/area)，并进行统计分析。

1.5PCR检测心肌组织中ERK1、ERK 2 mRNA表达 采用RT-PCR法检测：(1)总RNA 提取：称取20 mg左右大鼠心肌组织在研磨棒中研磨成匀浆，按总RNA提取试剂盒操作步骤提取总RAN，取总RNA于紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。(2)逆转录：按逆转录试剂盒说明书把总RNA逆转录成cDNA。(3)以cDNA为模板、以GAPDH为内参，对ERK1、ERK2基因进行扩增。PCR扩增：反应体系为10 μl PCR Master Mix (2×)，10 μmol/L上下游引物。引物序列：ERK1：上游：5′-CCCTTGACCTGAGTGATGAG-3′,下游：5′-CATAGCCCTTCCATTCCAGA-3′;ERK2:上游：5′-CACATCCTGGGTATTCTTGGA-3′,下游：5′-AGTCAGCGTTTGGGAACAAC-3′;GAPDH:上游：5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′,下游：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。cDNA模板2 μl，反应液体积为20 μl。反应条件94℃ 3 min 变性，94℃ 10 s；60℃ 40 s，40循环；72℃ 7 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，使用凝胶成像系统Image Lab进行条带图像采集。RT-PCR扩增：反应体系为12.5 μl TB Green，10 μmol/L上下游引物，cDNA模板(<100 ng)2 μl，反应液体积为25 μl。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40 个循环；95℃ 10 s。按标准曲线的反应体系及条件进行扩增。分别收集内参GAPDH及目的基因ERK1、ERK2的Ct值，根据 2-ΔΔCt公式计算相对表达量。

1.6统计学分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1一般情况 与CON组比较，随着周龄的增加，EPI模型组大鼠体重增加较少，说明EPI影响了低龄大鼠的生长发育。EPI模型组EPI腹腔注射后，部分开始出现精神萎靡、腹水、脱毛、活动量减少等现象，第9周出现2只大鼠死亡。EPO治疗组第10周1只大鼠死亡。第11周时取出两组心脏称重并计算心脏重量质量比，结果显示两组心脏重量质量比差异无统计学意义(P>0.05)，说明EPI不是通过心肌肥大导致心肌功能损伤。

2.2各组心肌组织病理学结果 心脏组织切片HE染色结果显示，CON组心肌纤维排列整齐、横纹清晰，细胞间隙正常，心肌细胞大小、形态正常；EPI模型组心肌细胞肿大、排列紊乱，胞质呈溶解状态、核深染，横纹模糊，细胞间隙扭曲增宽，可见部分肌原纤维溶解断裂。与EPI组比较，EPO治疗组及HBSP治疗组心肌纤维排列、心肌细胞大小、形态等形态学改变较少。见图1。

2.3各组心肌组织CytC、caspase-9蛋白表达 各组心肌组织CytC、caspase-9蛋白的阳性表达均为棕黄色颗粒，位于细胞质中。CON组仅有少量CytC、caspase-9蛋白表达。与CON组比较，EPI模型组心肌组织CytC、caspase-9蛋白表达明显增多(P<0.05)；与EPI模型组比较，EPO治疗组与HBSP治疗组心肌组织CytC、caspase-9蛋白表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。EPO治疗组与HBSP治疗组之间差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、图3、表1。

图1 各组心肌组织(HE染色，×400)

图2 各组心肌组织CytC表达(DAB染色,×400)

图3 各组心肌caspase-9蛋白表达(DAB染色,×400)

表1 各组心肌组织CytC、caspase-9平均光密度

2.4各组心肌组织中 ERK mRNA表达变化 与CON组比较，EPI模型组心肌组织中ERK1、ERK2 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与EPI模型组比较，EPO治疗组和HBSP治疗组心肌组织中ERK1、ERK2 mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。EPO治疗组与HBSP治疗组ERK1、ERK2 mRNA表达比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表2。

图4 各组心肌caspase-9蛋白表达(DAB染色,×400)

表2 各组心肌组织ERK1、ERK2 mRNA 相对表达量比较

3 讨 论

蔥环类化疗药物，如阿霉素是目前许多肿瘤的重要治疗手段之一，但是此类化学药物容易产生心脏毒性。阿霉素治疗引起的急性或长期的心脏毒性受到了临床极大关注〔9〕。阿霉素诱导的线粒体功能障碍是阿霉素心脏毒性作用的重要机制，进而诱导活性氧增多、心肌细胞凋亡增加和心脏功能下降〔10〕。阿霉素可直接通过线粒体和(或)通过氧化应激和细胞内高钙来刺激caspase-3诱导的凋亡。增加抗凋亡因子B细胞淋巴瘤(Bcl)-2 的表达和降低促凋亡因子caspase-3和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达可改善阿霉素诱导的心肌细胞凋亡〔11〕。由细胞自发进行的内源性凋亡大部分是以线粒体为中心进行的并由线粒体调节。细胞毒性应激能触发内源性凋亡途径，在dATP的作用下，CytC引发凋亡蛋白酶激活因子-1寡聚成大蛋白支架，即凋亡小体，凋亡小体可以激活caspase-9，caspase-9进而激活效应caspase〔12〕，caspase-3能够裂解一系列的死亡底物，这些死亡底物的裂解会诱导凋亡细胞发生DNA片段化、细胞核碎片化、断裂细胞膜起泡等一系列细胞表型和生化指标的改变，完成细胞凋亡。

研究发现EPO对多种心脏疾病具有重要的保护作用〔13〕，EPO可缓解氧化应激及炎症反应，促进血管再生，减少心肌梗死急性期有害物质的释放，改善心肌重构及心脏舒缩功能，对持续性损伤的心肌细胞具有重要的保护作用〔14〕。EPO需要大剂量才能发挥组织保护作用，会造成对骨髓造血系统的过度刺激〔15〕。螺旋B表面肽(HBSP)是一种新发现的具有组织保护作用的促红细胞生成素衍生肽，在肾脏〔16〕、肺脏〔17〕及肝脏〔18〕中发挥保护作用。Lin等〔19〕研究发现HBSP保护心肌缺氧/复氧诱导的过度自噬和细胞凋亡。近年来，体内外实验均证实了HBSP在心脏中的保护作用。HBSP在心肌梗死〔20、21〕、糖尿病心肌病〔22〕及心肌缺血再灌注损伤模型〔23〕中具有抗心肌凋亡及减轻心肌损伤等作用。

由本研究病理学结果可证实EPI诱导的大鼠心肌损伤模型构建成功，实验结果说明HBSP、EPO改善EPI模型大鼠的心肌损伤。本研究还发现EPI可能是通过线粒体释放CytC，激活caspase-9通路来促进心肌细胞凋亡，加重心肌损害。而HBSP及EPO可能是降低线粒体释放凋亡相关因子CytC，抑制caspase-9表达来抑制心肌细胞凋亡，从而发挥心肌保护作用。EPO、HBSP与EPOR-βcR结合后可以激活多种信号通路抑制凋亡、炎症发挥组织保护作用〔24〕。第一条通路：PI3K/Akt；第二条通路：ERK1/2/MAPK；第三条通路：信号转导和转录激活因子 (STAT)3通路。本研究前期结果显示，EPO与HBSP通过PI3K/Akt信号通路改善EPI所致心肌损伤模型大鼠心肌损伤。HBSP还可以通过抑制自噬Akt-哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)〔25〕信号通路减轻心肌缺血/再灌注损伤，减轻炎症因子Akt/糖原合成酶激酶(Gsk)-3β〔26〕信号通路减轻糖尿病心肌病损伤。研究证实在心肌梗死、心肌缺血再灌注及扩张型心肌病动物模型中ERK1/2信号通路参与了心肌损伤保护机制〔27〕。

本研究结果表明，各组均有ERK1、ERK2 mRNA的表达，RT-PCR结果说明HBSP比EPO对ERK1、ERK2基因的表达更具有促进作用。因此，HBSP及EPO改善EPI模型大鼠的心肌损伤可能通过ERK1/2信号通路发挥作用。HBSP改善心肌损伤更强，可能是HBSP通过抑制Akt-mTOR、Akt/Gsk-3β信号通路来进一步减轻心肌损伤，需要实验证实。由此推论HBSP具有抑制细胞凋亡，保护心肌细胞损伤的作用，其机制可能通过激活ERK1/2信号通路来减少CytC蛋白的表达，降低 caspase-9蛋白的表达，减少CytC释放，抑制 caspase-9蛋白活性有关。

综上，ERK1/2的表达与保护心肌损伤关系密切，HBSP对EPI诱导的大鼠心肌损伤模型中ERK1/2基因的表达有干预作用，为化疗药物引起的心肌损伤新药研究及靶向治疗提供新思路。本实验不足之处，无ERK1/2特异性阻断剂，无法直接证明ERK1/2信号通路抗心肌细胞损伤，HBSP可能通过多条通路保护心肌，有待后续实验中进一步研究。