CircRNA影响NSCLC增殖、侵袭相关信号通路研究进展

高圣钰 刘爽 魏微微 李萌 陈思宇 孟凡石

(佳木斯大学 1附属第一医院普外一科，黑龙江 佳木斯 154002；2基础医学院)

肺癌(LC)患病率和病死率在全球范围内呈逐年递增趋势。2018年全球癌症协会统计全球新增病例约有209万和死亡病例约有176万〔1〕。LC现在已经成为全球最常见的恶性肿瘤和致死原因之一〔2〕。依据组织病理学可以将LC分为占80%～85%非小细胞肺癌(NSCLC)及占15%～20%小细胞肺癌(SCLC)〔3〕。虽然近代医学在诊断技术及治疗手段 (包括手术、放疗和化疗)方面不断进步，但大部分LC患者就诊时已进入晚期〔4〕。Sun等〔4〕报道早期LC可以治愈，所以确定LC生物标志物或治疗靶点对降低死亡率和改善临床预后具有重大意义。随着高通量测序技术和生物信息学分析技术的发展，许多研究表明环状RNA(CircRNA)在癌症中影响细胞侵袭、迁移和增殖。Yao等〔5〕通过分析来自宁波第二医院的94例肺腺癌(LUAD)组织和临近正常组织发现，circ-0006427在LUAD中表达活跃，调高Dicckkopf相关蛋白(DKK)1的表达量，可以使Wnt/β-catenin信号通路失活，抑制LUAD的增殖、迁移和侵袭。CircRNAs是蛋白质编码基因的完整外显子产生的，其通过反向剪接的过程生成。由于缺少游离的3′或5′末端，CircRNAs的半衰期较长，这使其对线性RNA衰变的常规机制具有抵抗力。此外有研究表明CricRNAs可以通过信号通路影响癌组织的转移、增殖及侵袭，可以为LC的治疗提供新的靶点。然而CircRNAs通过影响信号通路调节LC的分子机制尚未完全明确。本文就CircRNAs通过信号通路影响NSCLC发生发展的进展进行总结。

1 CircRNA的生物学功能

CircRNAs是一种特殊的非编码RNA分子，CircRNAs的结构是共价封闭的环，在3′端没有聚腺苷酸尾，在5′端没有帽状结构，其大小为100 bp至4 kb〔6～9〕。CircRNA的特殊结构使它更耐核糖核酸酶(RNase)或RNA外核酶降解。CircRNAs的功能是可以作为miRNA的海绵参与细胞的生物学过程，还可以调节亲本基因的转录，同时能作为蛋白质之间的衔接子发挥作用及具有蛋白质翻译功能〔2，7，10，11〕。Militello等〔12〕研究表明CircRNAs可能是肿瘤中的特殊分子标记物。

2 CircRNAs调控信号通路参与NSCLC的发生发展

2.1CircRNA与Wnt信号通路 Wnt/β-catenin是经典的信号通路〔13〕。Peng等〔14〕报道circRNAs通过影响Wnt通路的激活与失活调节癌症的发生进展。Wan等〔15〕对隶属于华中科技大学同济医学院的同济医院病理科，经病理确诊的78例NSCLC患者癌与癌旁组织及NSCLC细胞系A549、NCI-H460进行荧光定量逆转录PCR(RT-qPCR)定量检测，结果显示circ-E3泛素化蛋白链接酶(ITCH)在NSCLC组织和NSCLC细胞系(A549、NCI-H460)中表达量降低。通过调高体外NSCLC细胞系A549和NCI-H460中circ-ITCH表达量，circ-ITCH可以竞争性的抑制miR-7和miR-214与ITCH相结合，促进ITCH表达水平增高。而ITCH是E3泛素连接酶的成员，该酶可以调节蛋白质的稳定性、免疫反应及癌症的进展。所以当ITCH表达活跃后可以促进磷酸化蓬乱蛋白(Dvl)2的降解使Wnt/β-catenin信号失活〔16〕，导致通路下游调节细胞黏附的β-catenin、参与细胞增殖、细胞生长的原癌基因(c-Myc)及参与调控细胞周期的细胞周期素D1表达失活，从而抑制NSCLC细胞增殖。Yao等〔17〕通过对宁波市第二医院收集的72对原发性LVAD患者的癌与癌旁组织进行微阵列分析，发现circ-0001946表达量升高。同时应用RT-qPCR对LUAD细胞系(H1299、A549、Calu3、 SPC-A1)中circ-0001946的含量进行测定，结果表明circ-0001946在四组细胞系中表达活跃。应用细胞转染技术降低A549和H1299细胞系中circ-0001946表达量可以明显抑制LAC体外细胞的增殖，促进细胞凋亡。而后通过生物信息学技术预测miR-135a-5p的下游靶基因为沉默调节蛋白(SIRT)1，而SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰基酶，可以调节Wnt信号通路的激活〔18〕。所以当circ-0001946与miR-135a-5p结合，SIRT1表达活跃使Wnt/β-catenin通路激活，导致通路下游调节细胞黏附的β-catenin、参与细胞增殖和细胞生长的原癌基因(c-Myc)及调节细胞周期的细胞周期素D1表达活跃，从而促进LUAD的增殖。Gao等〔19〕应用微阵列分析技术和RT-qPCR技术分别检测从吉林大学中日联合医院收集的LUAD癌组织及其临近的正常组织及LUAD细胞系(A549、SPC-A1、H1299、PC-9)中circ-SOX4的表达量，结果表明circ-SOX4在LUAD组织和细胞系中表达活跃。当circ-SOX4表达下调后，miR-1270与多形性腺瘤基因样(PLAGL)2相结合，导致PLAGL2表达量降低，而PLAGL2是一个假定C2h2锌指转录因子，其异常激活可以调节Wnt/β-catenin信号通路激活导致细胞增殖失调，促进癌症的发生〔20〕，所以PLAGL2表达失调后抑制Wnt通路激活，抑制其下游调节细胞生长和黏附的连环蛋白β1、参与调节细胞周期的细胞周期蛋白(CCND)1、同样起调节细胞周期作用的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2及调节细胞增殖的原癌基因c-Myc和影响癌细胞侵袭性的基质金属蛋白酶(MMP)2的表达，从而抑制LUAD中细胞增殖、侵袭、迁移和肿瘤生长。此外在A549和H299细胞株中上调circ-SOX4的表达量，可以抑制miR-1270活性，增加PLAGL2表达量，同时提高CD44和N-钙黏蛋白的蛋白质水平，降低E-钙黏蛋白的水平，继而促进癌细胞侵袭和转移。

2.2CircRNA与PI3K信号通路 PI3K/PKB又称磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路，其可以调节细胞增殖和凋亡，PI3K/PKB通路的异常激活可能与恶性肿瘤密切相关〔21〕。Wu等〔21〕通过研究检测60例NSCLC癌与癌旁组织中circ-环乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)的表达量，结果显示其表达量上调。通过抑制体外细胞系A549和H1299中circ-ACACA的表达。circ-ACACA活性降低诱导磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)激活，而PTEN作用机制是通过抑制PI3K途径下调信号传导的能力，继而抑制肿瘤细胞的发展〔22〕。所以PTEN表达活跃抑制PI3K/PKB信号通路下游靶基因p-PI3K/t-PI3K和p-PKB/t-PKB表达，从而抑制NSCLC的增殖和迁移。此外，circ-ACACA与miR-1183有结合位点，调高体外A549和H1299细胞系中circ-ACACA的表达量，导致miR-1184的活性降低，导致NSCLC细胞系中与细胞分化有关的c-Myc、与细胞迁移有关的明胶酶MMP9和与糖醇解有关的葡萄糖转运蛋白(GLUT)-1的蛋白水平升高，结果显示circ-ACACA的表达上调显著激活c-Myc、MMP9、GLUT-1蛋白活性，从而促进NSCLC细胞增殖和迁移并增强了瓦伯格效应。Bai等〔23〕对收集于烟台市玉皇顶医院的51例经病理确诊的NSCLC组织和邻近正常组织及购买于首尔国立大学医学院的A549、H1299细胞株进行RT-qPCR测量，结果显示circ蛋白激酶Cα(PRKCA)在NSCLC组织和A549、H1299细胞系中表达活跃。通过沉默NSCLC细胞系中circPRKCA表达，导致miR-330-5p活跃。而miR-330-5p可以与3-磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)-1 3′非翻译编码区(UTR)结合，削弱PDK1的表达。而PDK1属于AGC激酶家族，代表PI3K途径的关键节点〔24〕。所以PDK1活跃度降低抑制PI3K/PKB信号通路激活，导致其下游PKB磷酸化水平降低，从而抑制NSCLC细胞外活力、迁移、侵袭。

2.3CircRNA与核转录因子(NF)-κB信号通路 NF-κB信号通路在癌症的进展中起重要作用，NF-κB可以参与调节癌症基因的表达，影响癌细胞的增殖、迁移和凋亡〔25〕。Zhou等〔26〕对收集于中国科学院大学肿瘤医院的32例LUAD组织和邻近正常组织进行检测，结果表明circ_cMras在LUAD组织中表达降低。荧光定量PCR技术测得LUAD细胞系A549、HCC827中circ_cMras水平降低。表明通过使A549、HCC827细胞系中circ_cMras异常表达，可以降低LUAD细胞的增殖、迁移、侵袭，加快细胞凋亡。其机制是通过转染调高细胞系A549、HCC827中circ_cMras表达量，使ABHD5活跃，而ABHD5是含α-β水解酶结构域5，是脂肪甘油三酸酯脂肪酶(ATGL)介导的脂解的高度保守的调节剂〔27〕。ABHD5可以通过脂多糖依赖性激活相关通路抑制癌细胞的合成代谢〔10〕。所以当ABHD5表达上调，ABHD5作为ATGL的共激活因子协同上调，从而抑制NF-κB通路激活，使其下游p-P65磷酸化活性下降，抑制LUAD细胞的迁移、增殖，加速细胞凋亡。

2.4CircRNA与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路 CircRNA通过调节MAPK信号通路激活或失活，影响细胞分化、凋亡、血管生成、增殖和肿瘤扩散〔28〕。circ-ZKSCAN1(hsa_circ_0001727) 是 一 种 来 源 于 ZKSCAN1基因第二和第三外显子(全长668 bp)的RNA〔29〕。Wang等〔29〕通过对收集于青岛大学附属医院胸外科的107例NSCLC癌与癌旁组织进行RT-qPCR检测，结果表明circ-ZKSCAN1在NSCLC组织中表达量增高。同时在NSCLC细胞系(A549、H1299)中circ-ZKSCAN1也同样检测到其水平升高。表明在细胞系A549、H1299中敲除Circ-ZKSCAN1，可以减慢细胞增殖、迁移，同时加快细胞的凋亡。此外，circ-ZKSCAN1高表达可以与miR-330-5p结合，抑制miR-330-5p与FAM83A的3′UTR区域结合。而FAM83A是具有序列相似性家族成员A，其位于8号染色体上参与细胞增殖、分化和凋亡〔28，29〕。FAM83A可以通过抑制MAPK通路发挥作用，所以当FAM83A表达活跃，导致MAPK通路失活。其下游参与细胞凋亡的c-Jun氨基末端激酶(JNK)和同样参与细胞凋亡的促分裂原激活的蛋白激酶(p38)，参与调节细胞增殖、分化的细胞外信号调节激酶(ERK)表达量降低，从而促进NSCLC增殖分化、迁移及减缓细胞凋亡。

2.5CircRNA与Janus激酶(JAK)2/信号转导和转录激活(STAT)3信号通路 JAK2/STAT3信号通路的失调与许多癌症的进展和转移有关〔30，31〕。Li等〔31〕研究发现Circ_ZNF124在肺癌细胞系(A549、H1975、H1299、HCC827)中高表达。随机选取A549、H975细胞系通过转染敲低circ_ZNF124表达水平，发现其可以诱导A549、H1975细胞周期停滞，降低其细胞增殖和转移的能力。降低circ_ZNF124在细胞系A549和H1975中的表达量，导致miR-337-3p水平活跃，作为miR-337-3p下游靶基因的JAK2和STAT3活性被抑制，使JAK2/STAT3信号通路失活，其参与细胞凋亡的B细胞淋巴瘤(BCL)2、参与细胞分化、增殖、存活、缺氧的原癌基因(c-FOS)和参与糖醇解的异二聚体转录因子低氧诱导因子(HIF)1的亚基(HIF1a)的靶基因活性受到抑制，导致NSCLC细胞迁移、增殖被抑制，同时促进细胞凋亡。

综上，CircRNAs可以通过Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、NF-κB、MAPK、JAK2/STAT3信号通路影响LC的迁移、增殖、侵袭，调节细胞凋亡。同时发现在甲状腺癌35、乳腺癌36等恶性肿瘤中CircRNAs也可以通过信号通路调控细胞的增殖、迁移、侵袭。遗憾的是CircRNA目前种类众多，还存在有尚未完善的信号通路，如AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)、Notch、骨形态发生蛋白(BMP)等信号通路。研究CircRNA通过信号通路影响LC增殖、侵袭的分子机制可能为LC的治疗提供新的思路。