响应面法优化卡氏芽孢杆菌ST-1产芽孢发酵培养基

李 敏，黄 满，邱炜玥，李焕梅，贾子民，龙 同，赵锦芳

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室，湖北武汉 430068；2.湖北省生物农药工程研究中心，湖北 武汉 430064）

芽孢杆菌（Bacillussp.）是重要的资源微生物，具有繁殖速度快，营养要求简单，抗逆性强，对人畜安全无害等优点，广泛应用于生物防控[1]、饲料加工[2]、水产养殖等领域[3]。目前，国内外已经开发出许多芽孢杆菌生防产品，其主要通过拮抗作用抑制植物病原菌的生长繁殖，可分泌多种活性物质，如抗菌肽[4]、酶类和抗生素（细菌素、伊枯草菌素等脂肽类化合物和聚酮类化合物）[5-7]。

2019年VILLALOBOS S D等[8]从墨西哥雅基山谷分离得到一株小麦内生芽孢杆菌，通过全基因组测序分析，结合形态学鉴定、生理生化试验，发现其为一种新型芽孢杆菌，命名为卡氏芽孢杆菌（Bacillus cabrialesii）TE3T。2021年该团队进一步研究证实B.cabrialesiiTE3T的无细胞滤液（cell-free culture filtrate，CF）对小麦离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）有显著抑制活性，半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为（0.1±0.01）%，最低抑菌浓度（minimum inhibitoryconcentration，MIC）为1%[9]。B.cabrialesiiTE3T的生长动力学表明，其活性代谢物质主要在对数生长后期开始产生，在稳定期达到最大值，且活性物质稳定性强，可以耐受高温和蛋白酶K的降解，可作为生物防治和植物生长促进剂。2021年，ZHOU L等[10]从番茄根际土壤中分离得到一株卡氏芽孢杆菌（B.cabrialesii）BH5，通过研究发现，其能够抑制番茄灰霉的病原菌葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的生长，通过高效液相色谱-电喷雾串联质谱（high performance liquid chromatography-electrospray ionizationtandem mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）鉴定，得到一种环脂肽化合物为丰霉素H，进一步试验证实该化合物可引发菌丝细胞膜的缺陷。

本研究团队前期从湖北省恩施州鹤峰县森林植物根际土壤样品中分离得到一株卡氏芽孢杆（Bacillus cabrialesii）ST-1，通过研究发现其对植物病原真菌具有广谱抑菌活性，对香梨腐烂病、梨轮纹病及甘薯病害均具有显著防效，极具进一步研究开发潜力。为了筛选到低成本、易获得的培养基配方，获得高浓度的卡氏芽孢杆菌芽孢数，本研究以芽孢数为响应值，采用单因素试验及响应面试验对Bacillus cabrialesiiST-1的培养基配方进行优化，得出其最优培养基配方，以期为该菌株规模化生产及工业化应用提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

卡氏芽孢杆菌（Bacillus cabrialesii）ST-1：分离自湖北省恩施州鹤峰县森林植物根际土壤样品，保藏于湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室。GenBank登录号为ON631788.1。

1.1.2 试剂

甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乙酸钠、蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、硝酸钾、酵母浸粉（均为生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；玉米粕、麸皮、米糠、豆粕、花生粕（均为生化试剂）：湖北工业大学南区菜市场。其他试剂均为国产分析纯或生化试剂。

1.1.3 培养基

初始发酵培养基（LB液体培养基）[11]：蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L和酵母浸粉5.0 g/L，pH自然，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。LB固体培养基：LB液体培养基中添加琼脂粉20.0 g/L。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS全自动数显高压蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司；DNP-9022生化培养箱：上海精宏分析仪器制造有限公司；ZHWY-2102C恒温摇床、ZFD-5430电热鼓风干燥箱：上海智城分析仪器制造有限公司；ZHJH-1214B洁净工作台：苏州净化设备有限公司；AR-1140精密天平：梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1Bacillus cabrialesiiST-1的活化及种子液的制备

活化：将斜面保存的Bacillus cabrialesiiST-1接种于含有2%葡萄糖的LB液体培养基中，在30 ℃、200 r/min的条件下摇床培养16 h。

种子液的制备：按照2%（V/V）的接种量将活化的BacilluscabrialesiiST-1接种于LB液体培养基，30℃、200r/min的条件下培养24 h，得菌株ST-1种子液。

1.3.2Bacillus cabrialesiiST-1产芽孢发酵培养基的优化

（1）单因素试验

采用单因素轮换法，在LB培养基的基础上，依次考察碳源种类（甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乙酸钠、蔗糖）（碳源添加量为10.0 g/L）及最佳碳源添加量（5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L）、氮源种类（玉米粕、蛋白胨、牛肉膏、硝酸钾、麸皮、米糠、豆粕、花生粕、酵母浸粉）（氮源添加量为10.0 g/L）及最佳氮源添加量（5.0 g/L、10.0 g/L、15.0 g/L、20.0 g/L、25.0 g/L）对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数的影响。

选取产芽孢效果好的氮源与低成本氮源进行复配（总添加量为20.0 g/L），研究不同复配比例（1∶1、1∶2、1∶3）对卡氏芽孢杆菌ST-1芽孢数的影响。最后，在固定最适碳源及氮源的基础上，以未添加无机盐的培养基为对照（CK），考察无机盐种类（磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸锰、氯化钙、七水硫酸镁）（添加量为1.0 g/L）、磷酸二氢钾添加量（1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L）、七水硫酸镁添加量（0.25 g/L、0.5 g/L、0.75 g/L、1.0 g/L、1.25 g/L）对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数的影响。

（2）Plackett-burrnan试验设计

在单因素试验基础上选取蔗糖（X1）、麸皮和蛋白胨（1∶2）（X2）、磷酸二氢钾（X3）、七水硫酸镁（X4）添加量为自变量，分别设计低水平（-1）和高水平（1），进行n=12的Plackett-Burman（PB）试验，快速筛选对芽孢数影响最大的组分，PB试验设计因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman设计试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）最陡爬坡试验设计

根据Plackett-Burman试验结果筛选显著影响因素，并根据各显著影响因素效应的大小设定步长及变化方向，以便快速逼近最佳区域。根据各因素效应的正负和大小确定取值，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。通过最陡爬坡试验逼近最大影响因素的最佳水平。

（4）响应面试验设计

以最陡爬坡法试验筛选出的3个关键因素蔗糖添加量（A）、麸皮+蛋白胨（1∶2）添加量（B）及磷酸二氢钾添加量（C）的相对高水平作为中心点，设计3因素3水平的中心组合试验设计（central composite design，CCD），响应面试验设计因素与水平见表2。

表2 响应面试验设计因素及水平Table 2 Factors and levels of response surface tests design

采用软件Design-Expert 10.0对试验结果进行多元回归拟合分析，构建响应面曲面图，拟合出各因素水平和芽孢数之间的回归方程。

1.3.3 芽孢数的测定

采用平板计数法检测芽孢数。取发酵芽孢悬液，釆用10倍梯度稀释法制成适宜稀释度的供试液。取各100 μL分别涂布于LB固体培养基，平行涂布3个平板，在37 ℃倒置培养12 h后计数。

1.3.4 数据处理及统计分析

试验数据使用软件SPSS 26.0和Minitab 19进行数据处理和分析。所有试验重复3次，实验结果用“平均值±标准偏差”表示；采用Origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 Bacillus cabrialesii ST-1产芽孢培养基优化单因素试验

2.1.1 不同碳源及蔗糖添加量对菌株ST-1芽孢数的影响

不同碳源及蔗糖添加量对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数的影响见图1。

图1 碳源种类（A）及蔗糖添加量（B）对Bacillus cabrialesii ST-1芽孢数的影响Fig.1 Effect of carbon source types (A) and sucrose addition (B)on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

由图1A可知，蔗糖作为单一碳源时，芽孢数最多，达到15.96×108CFU/mL，其次是葡萄糖，芽孢数为12.74×108CFU/mL。已有研究报道证实，多种芽孢杆菌的最佳发酵碳源为蔗糖[12-13]，分析原因可能是蔗糖可为菌体发酵提供一个低渗透压的环境[14]，故确定最佳碳源为蔗糖。由图1B可知，随着蔗糖添加量的升高，芽孢数呈先升高后降低的趋势，分析原因可能是蔗糖添加量较少时，由于培养基中营养物质的缺乏，导致菌体生长受限；而当蔗糖添加量过多时，培养基的渗透压过高，从而导致菌体的生长受到抑制[15]。当蔗糖添加量为10.0 g/L时，芽孢数最大为16.63×108CFU/mL。因此，选择蔗糖的最优添加量为10.0g/L。

2.1.2 不同单一氮源及蛋白胨添加量对菌株ST-1芽孢数的影响

不同单一氮源及蛋白胨添加量对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数的影响见图2。由图2A可知，采用蛋白胨为单一氮源时，Bacillus cabrialesiiST-1的芽孢数最多，达18.56×108CFU/mL。有研究表明，不同种属的芽孢杆菌的最佳发酵培养基存在差异[16-17]。由图2B可知，随着蛋白胨添加量的增加，芽孢数呈先升高后下降的趋势，当蛋白胨添加量为20.0 g/L时，发酵液中的芽孢数最多，达到23.64×108CFU/mL。

图2 氮源种类（A）及蛋白胨添加量（B）对Bacillus cabrialesii ST-1芽孢数的影响Fig.2 Effect of nitrogen source types (A) and peptone addition (B)on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

2.1.3 不同氮源配比对菌株ST-1芽孢数的影响

麸皮为单一氮源时，Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数为5.81×108CFU/mL。麸皮是一种工业副产品，来源广泛、成本低，其粗蛋白含量丰富，同时含有纤维素、淀粉及维生素、无机盐和生长因子[18]，可进一步循环再利用。本研究选用产芽孢效果好的蛋白胨与低成本麸皮进行复配，考察复合氮源（添加量为20.0 g/L）对Bacillus cabrialesiiST-1发酵产芽孢的影响，结果见表3。

表3 不同复合氮源比例对Bacillus cabrialesii ST-1芽孢数的影响Table 3 Effect of different nitrogen sources ratio on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

由表3可知，当复合氮源为麸皮＋蛋白胨（1∶2）时，芽孢数最大，为28.50×108CFU/mL，显著高于麸皮与蛋白胨配比为1∶1、1∶3的复合氮源。分析主要原因可能是，芽孢杆菌在氮源充足的条件下，能够快速生长增殖并发酵产生多种水解酶，而麸皮本身除含有粗蛋白外，还含有较高的纤维、淀粉、维生素及生长因子等物质[18]，水解酶能够进一步分解其中的营养物质，促使芽孢杆菌生长繁殖，当二者以合适比例复配时，有利于Bacillus cabrialesiiST-1的发酵产孢。因此，选择麸皮与蛋白胨最适配比为1∶2。

2.1.4 不同无机盐及添加量对菌株ST-1芽孢数的影响

无机盐在微生物生长繁殖过程中有维持细胞内外渗透压，参与细胞代谢等功能[19]。5种无机盐离子（添加量为1.0 g/L）对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数的影响，结果见图3A。由图3A可知，添加磷酸二氢钾和七水硫酸镁时，Bacillus cabrialesiiST-1的芽孢数较多，分别为29.48×108CFU/mL和27.69×108CFU/mL。磷酸盐在生物发酵过程中既能促进菌体的基础代谢，又能影响许多代谢产物的生物合成[20]。Mg2+作为三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的辅助因子参与生物的各种生理生化反应，还是许多酶的活化剂[21]。金华等[22]研究发现，镁离子对丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）Z-10芽孢的形成具有显著的促进作用；林陈强等[23]研究发现，培养基中添加适量的镁离子对芽孢杆菌CHB201的菌体生长和芽孢形成有显著影响。因此，选用磷酸二氢钾与七水硫酸镁进行后续试验，分别研究其添加量对Bacillus cabrialesiiST-1产芽孢数的影响，结果分别见图3B和3C。由图3B和3C可知，随着磷酸二氢钾添加量或七水硫酸镁添加量的增加，芽孢数均呈先升高后下降的趋势。当磷酸二氢钾添加量为3.0 g/L时，芽孢数达到最大，为35.73×108CFU/mL；当七水硫酸镁添加量为0.50 g/L时，芽孢数达到最大，为34.14×108CFU/mL。分析原因可能是，磷酸盐添加量过少时，可能影响生物细胞代谢，添加过高的磷酸盐可能影响芽孢杆菌细胞内外的渗透压，CONRAD R等[24]通过放射性同位素标记试验研究发现，磷酸盐≥20 mmol/L对微生物具有明显抑制作用。七水硫酸镁含量较低时能够促进多种酶的活化，高含量的七水硫酸镁可能影响细胞内外的渗透压[25]。

图3 无机盐种类（A）及磷酸二氢钾（B）、七水硫酸镁（C）添加量对Bacillus cabrialesii ST-1芽孢数的影响Fig.3 Effect of inorganic salt types (A),potassium dihydrogen phosphate (B) and magnesium sulphate heptahydrate (C)addition on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

磷酸二氢钾与七水硫酸镁对Bacillus cabrialesiiST-1产芽孢无显著性差异，因此后续PB试验进一步考察磷酸二氢钾与七水硫酸镁对BacilluscabrialesiiST-1产芽孢的影响。

2.2 菌株ST-1产芽孢培养基优化PB试验

PB试验设计及结果见表4，主效应分析结果见表5。

表4 Plackett-Burman试验设计及结果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

续表

表5 Plackett-Burman试验主效应分析结果Table 5 Main effect analysis results of Plackett-Burman experiments

由表5可知，培养基中对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数有显著影响的因素包括蔗糖、麸皮与蛋白胨比例（1∶2）、磷酸二氢钾，其中蔗糖对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数的影响为正效应，麸皮和蛋白胨（1∶2）以及磷酸二氢钾对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数的影响为负效应，七水硫酸镁对Bacillus cabrialesiiST-1产芽孢的影响不显著（P＞0.05）。

2.3 菌株ST-1产芽孢培养基优化最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验结果设计最陡爬坡试验，试验设计及结果见表6。

表6 最陡爬坡试验设计及结果Table 6 Design and results of the steepest climb experiments

由表6可知，第4组试验，即在蔗糖添加量13.81g/L，麸皮＋蛋白胨（1∶2）添加量17 g/L，磷酸二氢钾添加量1.8 g/L条件下，菌株ST-1的芽孢数最高，为54.45×108CFU/mL。故采用蔗糖添加量13.81 g/L，麸皮＋蛋白胨（1∶2）添加量17 g/L，磷酸二氢钾添加量1.8 g/L为后续响应面试验的中心点。

2.4 响应面试验设计及结果

试验设计及结果见表7，回归模型方差分析见表8。

表8 回归模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

采用Design-Expert 10.0软件对表7试验数据进行多元二次回归拟合分析，得出二次多项回归方差为：Y=59.700-0.350A-0.062B-0.438C-1.150A2-1.525B2-1.875C2+0.325AB-0.675AC-1.250BC。

表7 响应面试验设计及结果Table 7 Design and results of response surface tests design

由表8可知，模型P=0.014＜0.05，表明模型对结果影响显著（P＜0.05）；失拟项对结果影响不显著（P＞0.05），表明模型能对Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数进行较好的分析和预测。决定系数R2=0.917 7，表明预测有8.23%的变异情况不能由该模型解释。调整决定系数R2adj=0.843 6，表明剔除自变量个数对R2的影响后系数为0.843 6。由P值可知，交互项BC及二次项A2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AC对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。各因素间交互作用对芽孢数影响的响应面及等高线图见图4。

图4 各因素间交互作用对Bacillus cabrialesii ST-1芽孢数影响的响应曲面及等高线Fig.4 Response surfaces plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the spore number of Bacillus cabrialesii ST-1

由图4可知，响应面呈明显的凸面，等高线均呈椭圆形，说明交互作用AC、BC对结果影响显著，与表8方差分析结果一致。采用Design-Expert 10.0软件对回归方程进行最优求解，得到最优培养基配方为蔗糖添加量13.1 g/L，麸皮＋蛋白胨添加量（1∶2）17.0 g/L，磷酸二氢钾添加量2.0 g/L，在此优化条件下，Bacillus cabrialesiiST-1芽孢数理论值达到最大，为5.97×109CFU/mL，通过发酵验证，得到芽孢数实际值为5.96×109CFU/mL，与理论值5.97×109CFU/mL相近。说明模型预测可靠。

3 结论

本研究以芽孢数为响应值，通过单因素试验和响应面试验得到Bacillus cabrialesiiST-1产芽孢的最优发酵培养基配方为蔗糖13.1 g/L，麸皮+蛋白胨（1∶2）17.0 g/L，磷酸二氢钾2.0g/L。在此优化条件下，BacilluscabrialesiiST-1的芽孢数为5.96×109CFU/mL，是优化前芽孢数（1.85×108CFU/mL）的32.21倍。本研究结果为菌株ST-1后续小试及工业化生产提供了数据参考，同时也为利用Bacillus cabrialesiiST-1开发生防制剂奠定了基础。在后续研究中，将对Bacillus cabrialesiiST-1培养条件及方式进行研究，进一步提高其芽孢数。