双酚A对小鼠卵巢卵泡AMH表达的研究

王尹强，高占芳，徐 睿，蒋香菊

(新疆第二医学院，新疆克拉玛依 834000)

双酚A( Bisphenol A，BPA)属于双酚类化合物，是一种合成高分子材料的单体，常用于生产增塑剂、杀虫剂、油漆和其他化学产品。BPA 单体可从塑料容器中分解，在高温、强酸或强碱条件下会加速释放过程[1]。双酚A通过不同方式影响人类内分泌和代谢，导致代谢紊乱。研究表明，BPA可通过皮肤、呼吸道等途径进入人体，可对神经、免疫、内分泌等多个系统造成不良作用[2]。尽管BPA能以萄糖醛酸苷或硫酸盐结合物的形式从尿液中排出体外，但由于其结合-解离时间较长，会导致排泄延迟而进入组织中。BPA暴露在日常生活中，难以检测，具有慢性毒性作用。流行病学研究表明，超过90%的人的尿液、孕妇血清、母乳、羊水、脐血和胎盘中都可检测到BPA[3]。双酚A不仅对女性生殖系统造成不同程度的影响和损伤，还会对子代的生育能力产生严重影响。

研究表明，在用低剂量的BPA处理怀孕小鼠后，雌性后代的体重和子宫湿重均下降，表明BPA对幼年大鼠卵巢发育有一定的抑制作用[4]。在关于BPA对人工授精成功率影响的研究中发现，尿液中BPA浓度越高，次级卵泡、成熟卵泡的总数越少，表明BPA会损害卵细胞的形成、成熟和授精能力[5-6]。

女性的血清抗苗勒管激素(AMH)水平可能代表卵巢卵泡储备，在辅助生殖技术定量和定性预测中具有重要作用。AMH的生理功能主要包括抑制原始卵泡的募集，减缓原始卵泡的早期快速消耗，降低卵泡对雌激素的敏感性，抑制卵泡的生长和发育，阻碍优势卵泡的选择[7]，影响初级卵泡和次级卵泡对卵泡刺激素(FSH )的反应，进而调节卵泡的发育[8]。因此，AMH的表达可能与卵泡障碍性疾病密切相关[9]。

双酚A作为一种日常生活经常接触的化学物质，具有类似雌性激素的活性，已被证实可对女性生殖健康造成一定的危害，如引起肿瘤和不孕症，但具体机制还不明确。而AMH可作为卵巢储备和肿瘤的标志物，但目前还不清楚BPA是否影响卵巢AMH的表达。以健康性成熟的雌性小鼠为研究对象，对其进行不同浓度的BPA处理，检测不同浓度处理小鼠后的卵巢重量、卵泡构成及AMH在卵泡中的表达特征，探究BPA是否通过调控抗苗勒管激素(AMH)表达量改变而引起青春期雌性小鼠的卵巢功能和结构变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物的分组与处理方法

取24只6周、体重30～35 g的SPF级昆明系雌性小鼠，于21℃～26℃、50%～70%的相对湿度环境中饲养，自由摄食、饮水，4只/笼。适应性饲喂1周后，随机选择18只小鼠分为3组(BPA 染毒 B 组、C 组、D 组)，分别用10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg浓度的双酚A灌胃，剩下6只为作为空白对照，灌胃等体积玉米油，处理后采集小鼠卵巢样品待检测。

1.2 样品处理

每个处理组小鼠随机选3只，取出卵巢用于组织观察和免疫组化分析。在固定液固定24 h后备用。

1.3 卵巢的组织切片及观察

分别对不同的卵巢样品脱水、包埋、切片、脱蜡、复水，对部分不同阶段和不同样品的卵泡HE染色观察。每种样品选出连续的2张进行常规HE染色照相对比分析，比对各组4个不同发育时期卵泡的形态结构差异。

1.4 免疫组化分析

选出不同样品的卵巢2张连续切片，做AMH的免疫组织化学染色观察。

2 结果

2.1 不同浓度BPA对卵泡发育的影响

HE染色结果如图1，可见卵巢组织结构相对比较完整，原始卵泡数量较多，血管较少，可看到处于不同发育阶段的卵泡。BPA 染毒 B 组、C 组、D 组卵巢组织出现不同程度的病理损伤，如出现出血性卵泡、大型窦状卵泡、多卵母细胞卵泡和卵巢囊肿样变化。随着BPA染毒剂量的不断增加，卵巢组织的病理变化也开始加重，异常卵泡的比例也逐渐增多，颗粒细胞层出现不规则裂隙更明显。

图1 HE染色 BPA 染毒 B 组、C 组、D组分别是(10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg BPA浓度)Fig.1 HE staining BPA contamination B group, C group, D group (10 mg/kg, 50 mg/kg, 250 mg/kg BPA concentration)

2.2 不同浓度BPA对卵巢组织AMH表达变化

免疫组化分析AMH在卵巢组织中的表达定位见图2。结果表明，C组和D组小鼠卵巢组织AMH表达量明显高于A和B组，即小鼠染毒BPA≥50 mg/kg会导致小鼠卵巢AMH表达量增多；而小鼠染毒 BPA在250 mg/kg 时，卵巢AMH表达量显著升高。

图2 BPA 染毒 E 组、F 组、G组、H组分别是(10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg BPA浓度)卵巢组织AMH表达的免疫组化检测结果，颗粒细胞分化为表达AMII(黑箭头↑ )Fig.2 BPA contamination E group, F group, G group and H group (10 mg/kg, 50 mg/kg and 250 mg/kg BPA concentration)ovarian tissue AMH expressed immunohistochemical test results, granule cells differentiating expression AMII(black arrow↑)

3 讨论

双酚A作为化工中间体，分布广泛，对环境的污染也越来越严重。双酚A是人们日常生活中经常接触的化学物质之一，人体会通过呼吸、皮肤黏膜接触等方式摄入双酚A。BPA可能影响未成熟雌性小鼠的生殖发育，从而影响其成熟后的生殖功能。数据表明，血液中BPA水平与许多女性生殖健康问题有关，包括子宫内膜增生、流产、不孕和多囊卵巢综合征(PCOS)[10]。作为转化生长因子β(TGF-β)超家族成员之一，抗苗勒管激素(AMH)能显著诱导苗勒管退化，在没有AMH的情况下，苗勒管发育成子宫、输卵管和阴道上部[11]，AMH仅在性腺中产生，并参与卵泡生长和发育调节。卵巢中，AMH由早期发育卵泡的颗粒细胞产生，能够抑制原始卵泡的生长。由于AMH在整个卵泡发生过程中表达，故从初级卵泡到窦状卵泡期，血清AMH水平可能代表卵巢卵泡储备的数量和质量。AMH不仅在哺乳类性腺发育早期中发挥作用，在后期两性的性腺发育也都起着调控作用。

通过在小鼠性成熟期人为灌胃BPA溶液，成功构建了小鼠卵巢损伤模型，通过不同浓度(10 mg/kg、50 mg/kg、250 mg/kg浓度组)的探索，为后续制作相关卵巢疾病模型提供了依据。通过分析不同浓度组小鼠卵巢结构的变化，证明了BPA会造成小鼠卵巢发育异常，且随着浓度的增加对颗粒细胞的损伤也逐渐增加。结果表明，250 mg/kg组小鼠卵巢组织中AMH基因的表达明显比其他两组高，说明双酚A能够显著抑制卵泡的生长和发育，减少卵巢中卵泡的数量。BPA组闭锁卵泡数高于对照组，而总卵泡数、初级卵泡数和次级卵泡数低于对照组，说明BPA对卵巢功能有较强的损伤作用，主要作用于卵泡的发育和成熟过程。有研究证实，长期处于低剂量的BPA暴露下，次级卵泡数量会显著下降[12]，BPA会影响腔前卵泡的发育，机制主要是通过抑制颗粒细胞中雌激素的合成和分泌来调控。生长分化因子9(GDF-9)和骨形成蛋白15(BMP-15)在卵泡发育和颗粒细胞增殖中的作用已得到证实，本研究再次证实了AMH在卵泡发育中的重要作用。