当归大球盖菇双向液体发酵液抗氧化性能测定

杜展颜 钱丽娟 高 捷 孙玉军

（安徽科技学院生命与健康科学学院，安徽凤阳 233100）

大球盖菇（Stropharia rugosoannulata），又名酒红色球盖菇、赤松茸，是联合国粮农组织向发展中国家推荐的主栽食用菌品种之一［1］，具有预防冠心病、助消化、疏解人体精神疲劳之功效,大球盖菇中蛋白质含量很高，为其干重的13%～46%，涵盖8种必需氨基酸等18种氨基酸，具有低糖低脂肪、多种氨基酸并存的特点［2］。大球盖菇含有多糖、留醇、黄酮、酚类物质、凝集素等生物活性成分，具有抗氧化、抑菌、抑制肿瘤、降血糖等药理作用［3］。

当归［Angelica sinensis（Oliv.）Diels］幼苗忌日晒；成株耐强光，忌连作。从古至今当归一直贡献于妇科，具有良好的美容功效。据《神农本草经》记载，“妇人漏下绝子，诸恶疮疡金疮。煮饮之。”《本草纲目》记载，“治头痛，心腹诸痛，润肠胃筋骨、皮肤、治痈疽、排脓止痛、和血补血。”中药材当归中的多糖是其高活性成分，有抗氧化、抗衰、抗炎功效，亦有预防心肌梗塞和动脉硬化的功效［4］，据此以当归作为护肤品的功效成分［5］。当归主要成分中的有机酸阿魏酸，对酪氨酸酶具有抑制作用，有美白功能，但关于当归在护肤品中的氧化性研究鲜有报道。

双向发酵能够聚集中药与菌菇的活性成分，大幅提高其研究性能，如抗氧化性。药用真菌以添加了中草药的药性基质为培养基，吸收中草药中的活性成分，经过药用真菌丰富的酶系以及代谢的作用，会产生新的代谢产物［6］，原有的性能有所提升，发挥新的功效，提高利用率。发酵过程中的微生物可分泌多种酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶、糖化酶、果胶酶、纤维素酶等。双向发酵是当代研究员关注的焦点，也是生物学迈上新台阶的必由之路［7］。

当今人们对于化妆品层次与功效的追求激增，更天然和效果更好的化妆品深受消费者的青睐。中药和菌落双向发酵组合中却鲜有当归与大球盖菇组合的研究。本研究拟从大球盖菇菌株出发，采用当归与大球盖菇双向发酵获得发酵液，并对发酵液的多糖、蛋白、多酚等活性成分进行测定，同时探讨其抗氧化与抗紫外吸收能力，为当归资源的开发及当归与大球盖菇双向发酵液在护肤方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂与仪器

1.1.1 试验菌种 大球盖菇，由安徽科技学院食用菌研究所提供。

1.1.2 试剂 钼酸铵，德国Merk公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 试验仪器 冷冻干燥机（FD-1A-50，北京），旋转蒸发仪器（R-1001VN，郑州），离心机（L550，湖南），紫外可见分光光度计（U-T6PC，上海），高速分散器（XHFDY，宁波）。

1.2 试验方法

1.2.1 大球盖菇菌种的活化与种子液的制备 马铃薯、葡萄糖、琼脂按照50∶2∶5制备PDA固体培养基后将大球盖菇菌株接入，将接好的菌种放入培养箱28 ℃培养5 d。制备大球盖菇菌种种子液［8-9］：配制PDA液体培养基100 mL于250 mL容量瓶中。经灭菌锅灭菌，在超净工作台中将固体培养的大球盖菇接入液体培养基，并放在摇床上（180 min，28 ℃）培养5 d。

1.2.2 当归的处理 称取5 g当归，放入锥形瓶中，加水煮30 min至50 mL左右离心（5 000 r/min，15 min），离心后取上清液并用量筒计量，后放入灭菌锅中灭菌。

1.2.3 当归大球盖菇双发酵培养 准备PDA液体培养基，待高速分散器将制备的种子液破碎至均匀液体后将10 mL种子液与100 mL PDA液体培养基一同加入处理好的当归煎熬液中，放入摇床（180 min，28 ℃）培养5 d。

1.2.4 当归大球盖菇发酵液多糖含量的测定 使用硫酸-蒽酮法测定总多糖，分别当日配制2 mg/mL的蒽酮-硫酸试剂（称取200 mg蒽酮溶于100 mL浓硫酸中）和0.1 mg/mL葡萄糖溶液。制作葡萄糖标准曲线：取6个试管，分别吸取葡萄糖标准溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、1.00 mL，为控制仅单因素变量，各个试管中需加蒸馏水1.00、0.08、0.06、0.04、0.02、0，6个试管分别测定A620，重复3次。记录数据，横坐标和纵坐标分别为葡萄糖浓度与吸光度。取4.00 mL蒽酮-硫酸试剂至1.00 mL发酵液上清液10倍稀释液中摇匀，煮沸10 min，凉水冷却10 min，测定A620，重复3次。

1.2.5 当归大球盖菇发酵液蛋白含量的测定 考马斯亮蓝G-250与含蛋白的物质反应快且稳定，能快速达到平衡。故用考马斯亮蓝G-250试剂与不同浓度的标准蛋白质溶液（1 mg/mL）反应，制作标准曲线。取当归大球盖菇双向发酵液1 mL，加入考马斯亮蓝G-250试剂5 mL，测定蛋白含量。

1.2.6 当归大球盖菇发酵液多酚含量的测定 福林酚具有强氧化性，在碱性条件下，酚类物质可与钨钼酸发生反应，生成蓝色化合物，故采用福林酚比色法测量发酵液中多酚含量。发酵液中加入适量乙醇，75 ℃水浴，回流提取50 min，再用乙醇定容，分别吸取1.00 mL稀释20倍的多酚提取液和阿魏酸对照品溶液于试管中，并利用紫外可见分光光度计测定A745与标准曲线对照，可得发酵液中的多酚含量。

1.2.7 当归大球盖菇发酵液抗紫外线测定 通过测量样品在230、260、290、320和350 nm处的紫外UV-A区透过率，计算出紫外吸收率，以50%乙醇作为空白对照［8］，通过测定发酵液的透过率，评价发酵液的抗紫外性能。

1.2.8 当归大球盖菇发酵液抗氧化性能的测定 总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC）测定［9］，将发酵液5 000 r离心10 min获得上清液，称取10.65 g磷酸钠和4.95 g四水钼酸铵，量取33.35 mL浓硫酸，使三者全部溶于蒸馏水中，制得总体积为1 000 mL钼酸铵反应体系。取稀释10倍后的当归大球盖菇发酵液1.5 mL与3 mL的钼酸铵溶液，充分混合，于95 ℃水浴锅中水浴加热90 min。以0.025 mg/mL VC作为对照，水浴反应生成蓝色结合物。加热完毕后需放冷至室温，测定其A695处光吸收值。

DPPH自由基清除率的测定［10］。取3 mL 0.04 mg/mL乙醇DPPH溶液与3 mL当归大球盖菇菌发酵液混匀，避光30 min后测定A517值，3组平行试验，取其平均值。以VC作为阳性对照，根据以下公式计算当归大球盖菇菌发酵液的DPPH自由基清除率，以此评价当归大球盖菇菌发酵液抗氧化性能大小的另一指标。

其中，A1为样品组，A2为对照组，A3为空白对照组，反应无水乙醇与当归大球盖菇发酵液各3 mL得的吸光值A2，反应无水乙醇与DPPH各3 mL得吸光值A3。

2 结果与分析

2.1 当归大球盖菇发酵液多糖含量的测定测定A620处吸光值，得葡萄糖标准曲线。其回归方程：

在测定范围内，线性关系良好，故可测定发酵液葡萄糖含量。

当归大球盖菇发酵液冷却后，经硫酸-蒽酮法测定A620处吸光度值，3次平行试验结果分别为0.741、0.735和0.738，取其平均值0.738，代入回归方程，得多糖含量为0.086 8 mg/mL。多糖是测定抗氧化性的重要指标，护肤品中的多糖具有抗衰老、修复皮肤组织、美白保湿等功效。此发酵液的多糖含量较高，在护肤品的中可发挥着一定作用。

2.2 发酵液蛋白含量的测定测量A595处吸光值，得蛋白质的标准曲线。其回归方程：

在测定范围内，线性关系良好，故可测定发酵液蛋白含量。

发酵液蛋白含量=查表所得蛋白含量×稀释倍数=0.474 6 mg/mL。

测定结果表明，发酵液中蛋白含量较高。胶原蛋白能清除皮肤氧化过程中的有害物质，去除黑色素的沉淀，淡化皮肤斑点。植物和微生物中不含有胶原蛋白，故发酵液中的蛋白是否具有美白功能，有待进一步的考证。但发酵液蛋白质中的氨基酸具有亲水基团，易吸附水分子，能够起到保水的作用，具有护肤功能。

2.3 发酵液多酚含量的测定测量A745处吸光值，得阿魏酸的标准曲线。其回归方程：

在测定范围内，线性关系良好，故可测定发酵液多酚浓度。将试验测定的A745值代入曲线方程得x=0.074 mg/mL。发酵液总多酚含量=0.074 mg/mL×稀释倍数（20）=1.48 mg/mL。

多酚一直被称为一种天然的抗氧化剂，张凤杰等［11］的报道发酵植物作物中，阿魏酸浓度在发酵后的植物中最高［（420.6±1.8）μg/g］，较阿魏酸浓度在未发酵的植物提高了1421.2%［（26.3±0.3）μg/g］。中药当归中所含酚大多在细胞壁中以非游离态的形式存在［12］，在大球盖菇菌株的发酵作用下，能产生一些分解细胞壁的酶，从而导致当归细胞壁疏松，使多酚易于释放。发酵液中多酚中的酚羟基具有还原性，因此具有抗氧化功能，可以清除皮肤因太阳紫外线照射产生的自由基，减少色斑的生成，起到护肤的作用。

2.4 当归大球盖菇发酵液的紫外吸收测定由表1可知，当归大球盖菇发酵液在260 nm的波长附近有强吸收，这可能是由酪氨酸的苯环共轭双键或核酸吸收所致。在290～320 nm波长附近的光吸收，可能为发酵液中挥发油所致。故当归大球盖菇发酵液良好的紫外吸收能力，可以防止太阳光中紫外线的伤害，具有护肤功能。

表1 当归大球盖菇发酵液不同波长处的透光率

2.5 当归大球盖菇发酵液的抗氧化测定采用钼酸铵试剂测定得到当归大球盖菇发酵液总抗氧化能力A695的数值 为0.926，是0.025 mg/mL VC 的1.777 倍。发 酵 液 对DPPH自由基的清除率为74.66%，虽比阳性对照组VC的清除率要低，但发酵原液清除率达到74.66%，表明当归大球盖菇双向发酵液也具有较好的抗氧化能力。这可能是由于发酵液中阿魏酸、挥发油等物质提供了游离的氢，消除了自由基反应。当归大球盖发酵液的较高的抗氧化活性，可应用于护肤领域，具有护肤功能。

3 结论与讨论

该研究用植物和真菌通过双向发酵能够提高总抗氧化能力，植物细胞在真菌菌丝的穿透作用和水解酶、氧化酶等的酶解作用下，其中的抗氧化活性物质可以更好地释放出来［13-14］。当归大球盖菇的双向发酵过程中，发酵56 h时，其总抗氧化能力达到最大，此时可能是发酵产生了较多的多酚，如阿魏酸等。因此，该试验选择发酵56 h时的发酵液，作为研究对象，测定其多糖、蛋白、多酚含量，同时也测定其抗氧化活性和抗紫外线性能，为其在护肤品领域中的应用提供参考。

发酵液护肤品［15］与其他美容产品相比，前者是纯天然产品，无任何化学类添加剂，安全可靠，符合现代人们的消费理念和爱美人士的追捧，具有广阔的市场。

当归大球盖菇的双向发酵56 h获得的发酵液有很多活性物质，其多糖含量达0.868 mg/mL，蛋白质含量达0.475 mg/mL，多酚含量高达1.480 mg/mL；DPPH自由基清除率为74.66%，其总抗氧化能力（TAC）为0.025 mg/mL Vc的1.777倍。因此，当归与大球盖菇菌种双向发酵的发酵液具有良好的抗氧化性能，在护肤品行业具有一定的应用开发前景。