牛乳脂肪球膜组分分离鉴定及其功能性研究进展

王 聪，费 旭，王秀英，刘晓军

（1.大连工业大学实验仪器中心，辽宁 大连 116034；2.北京科拓恒通生物技术股份有限公司，北京 101400）

乳中的乳脂肪由乳腺细胞分泌，以直径0.2～15 μm的脂肪球形式存在，脂肪球外面被一层膜包裹，这层膜即乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）[1-2]。牛乳中MFGM含量存在较大差异，相对集中的报道显示脂肪球中MFGM质量分数约2%～6%[3]。近年来，关于MFGM的相关研究逐渐增加，MFGM在食品领域的应用受到广泛关注[4]。

MFGM具有厚度为10～50 nm的3 层结构，是由蛋白质（含糖蛋白）、酶、中性脂质和极性脂质（含磷脂）组成的复杂混合物[5]，其中内膜为单层膜，由来自内质网的蛋白质和极性脂质组成；外膜为双层膜，由蛋白质和极性脂质组成[6]。另外，在脂肪球分泌过程中，部分细胞质在分泌过程中可能残留于内膜和外膜之间。MFGM具有乳化特性，使乳脂肪球分散在乳中形成乳浊液[7-8]。

不同哺乳动物的MFGM特性会有所差异。MFGM的成分受牛的品种、泌乳期、泌乳季节、饲料等因素的影响，各组分含量也存在一定差异。牛乳的均质工艺、加工过程等对脂肪球膜蛋白的含量也有一定影响[9]。MFGM成分具有多种生物活性，例如抗胆固醇作用、抑制癌细胞生长和杀菌活性[10-11]，并且在提高新生儿的免疫功能、神经系统功能和营养功能中具有重要作用[12]。

基于此，本综述介绍MFGM的分离制备技术、结构、组分鉴定分析、生理活性及其应用特性的研究进展，以期为MFGM的应用提供参考。

1 乳脂肪球膜的分离制备

MFGM可以从新鲜牛乳、奶油、酪乳、黄油乳清等中进行不同程度的分离制备。其中影响MFGM得率的主要因素有3 个：原料乳种类等生物因素、温度等物理因素和盐离子等化学因素[13]。研究表明，热处理温度对乳中MFGM的完整性和稳定性有显著影响，当牛乳超过60 ℃时，MFGM中蛋白质可能发生变性，同时可能与乳清蛋白发生结合[14]；冻结和解冻也会导致乳脂肪球不稳定，对MFGM结构稳定性造成严重损害；分离过程中快速通入空气也会影响MFGM的稳定性。此外，所使用的原料种类、原料处理以及分离的方法均会影响MFGM的组成，并影响其理化性质[15]。因此，深入研究优化MFGM分离方法，避免以上因素带来的不利影响具有重要意义。

以新鲜牛乳为原料制备MFGM的报道较多，主要工艺分为脱脂、奶油清洗、MFGM释放、收集、干燥等工序[16]。首先将乳分离得到奶油和脱脂乳；再用3～5 倍体积的水或者盐溶液洗涤奶油2～3 次[17]，去除奶油中的酪蛋白和乳清蛋白；将洗涤后的奶油冷却至10 ℃后进行离心，促进脂肪相与水相分离；使用滤布过滤得到酪乳和黄油颗粒，将黄油颗粒在40～60 ℃下融化后进行离心，收集上层黄油和下层黄油乳清，将黄油乳清和酪乳混合，即获得MFGM悬浮液。MFGM悬浮液经酸化、盐析或超速离心除去残余脂类，最后干燥得到MFGM[18]。

当原料中的脂肪球膜含量较高时，适宜用作工业化提取脂肪球膜的原料。有研究报道了以酪乳粉为原材料制备MFGM，主要分为酪乳粉溶解、洗涤、离心分离、干燥等工序制备得到[19]。但是，酪乳中酪蛋白胶粒与脂肪球膜蛋白的形状相似性，干扰了MFGM的分离。也有研究报道，柠檬酸钠可以影响MFGM的分离，在酪乳中加入2%～5%的柠檬酸钠，酪蛋白微粒将解离成较小的颗粒，进而通过离心就可以将脂肪球膜沉淀出来[20]；酪乳添加柠檬酸盐处理后经0.1 μm滤膜过滤，可制备脂肪球膜浓缩物，这种浓缩物约含60%蛋白和35%的脂类[21]，而在这些蛋白质组分中脂肪球膜蛋白、乳清蛋白、其他蛋白分别占70%、24%、6%。向酪乳中添加凝乳酶可促进凝乳，此外有研究[22]调节酪乳pH值至4.6，然后去除酪蛋白，使用0.2 μm滤膜对酪乳进行微滤处理，进而从酪乳中提取脂肪球膜。微滤工艺条件的优化、酪乳的初始组成特性等均会影响MFGM的分离效果，相关工艺有待进一步研究。

根据相似相容原理，可以使用有机溶剂溶解萃取脂肪球膜脂类成分，但相应产品中的溶剂残留可能带来食品安全风险。超临界二氧化碳流体萃取法相对于传统的溶剂萃取法具有更多的优势。用超临界二氧化碳流体萃取工艺处理微滤得到的浓缩物，去除其中的非极性脂类物质，将获得较高浓度的脂肪球膜蛋白，但这种方法不能够将蛋白质和磷脂分开[23]。综上，乳中分离MFGM的主要流程如图1所示。

图1 从牛乳中分离MFGM及其主要组分的工艺流程Fig.1 Flow chart for the separation of MFGM and its major components from milk

在乳品工业中，通常选择酪乳或黄油乳清制备MFGM。在MFGM制备方面，除了采用盐溶液等物理分离方法外，也可以选用渗滤装置去除乳中的乳清蛋白和酪蛋白[24-25]。工业上通常采用两步法制备MFGM，即先使用凝乳酶或酸法凝结酪蛋白[26]，通过微滤去除酪蛋白；在随后的渗滤过程中，通过添加反渗透水的方式来维持进料量的稳定。或利用在酪乳加入柠檬酸钠后微滤除去酪蛋白，再通过高速离心的方法获得。

2 乳脂肪球膜的结构模型

MFGM由内部脂质单层和外部脂质双层结构构成，主要含有蛋白质（如糖蛋白和酶）、中性脂、极性脂质等成分。牛乳中的脂肪球形成于整个乳腺上皮细胞，随着它们向顶端细胞膜移动而增大，并被挤进肺泡腔，在挤压过程中，小球被细胞膜的一部分包裹，形成乳脂肪球和MFGM[27]。

近年来，MFGM的结构研究取得了一定的进展[28-29]。天然状态下，乳脂肪以分散的形式存在[30]，乳脂肪球外部有3 层膜，主要含有甘油磷脂、鞘磷脂、鞘糖脂、中性脂质、糖蛋白、酶及微量RNA等组分。此外，一些学者提出了MFGM结构模型（图2）[10,31-32]。

图2 MFGM结构示意图[10,31-32]Fig.2 Schematic diagram of the structure of MFGM[10,31-32]

目前MFGM的结构主要有两种模型。一种模型是学界广泛接受的流体镶嵌模型。MFGM大部分来源于分泌细胞的顶端质膜，以磷脂双分子层作为膜的骨架，处于流体状态；外周膜蛋白部分嵌入或松散地附着在双层膜上；跨膜蛋白通过脂质双分子层延伸；糖脂和糖蛋白的碳水化合物分子向外定向，而胆固醇存在于极性脂质双层结构中[33]。另外一种模型是为刚性脂质核模型，该模型具有刚性的脂质，周围环绕着更多由甘油磷脂和糖蛋白组成的液体脂质。MFGM由极性脂质、胆固醇、蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂和酶组成。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对牛MFGM中的蛋白质进行分析，结果表明MFGM含有多种多肽[34]。MFGM中的脂质主要为极性脂质，如PS、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）、PC、PE和SM等。饱和脂肪酸含量高的糖磷脂对MFGM的流动性具有重要影响。SM含有鞘氨酰基，通过酰胺键与脂肪酸分子结合，与磷酸胆碱或磷酸乙醇胺的一个极性头部基团酯化。SM主要含有饱和脂肪酸，因此SM具有较高的熔点。MFGM极性脂质分布不对称，PC和SM主要分布在膜的外层，PE、PS和PI集中在膜内表面[34-35]。

3 乳脂肪球膜的组成鉴定分析

MFGM成分复杂，由于原料种类、分离纯化以及分析方法不同，所以文献中MFGM的组成也存在较大差异[36]，同时，泌乳阶段、季节、饲料及脂肪球大小等因素也会影响MFGM的含量和组成[37]。MFGM中的蛋白质、脂质、多糖组分等的分子种类报道较多，但彼此之间差异较大。其中脂肪球膜占脂肪球总质量的2%～6%，由蛋白质、磷脂、甘油三酯、胆固醇和其他微量成分组成，蛋白质和磷脂约占脂肪球膜干质量的90%[38]。

3.1 蛋白质组成分析

从目前的报道情况来看，牛乳MFGM中蛋白质量分数约为25%～30%。由于MFGM的分离制备条件及分析方法不同等原因，工业化MFGM粉产品中蛋白质量分数最高达到60%左右。同时，不同研究中所报道的MFGM中蛋白质种类的数量也存在差异。芦晶等[39]使用纳升液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）进行蛋白质组学测定，在牛乳中鉴定出169 种乳脂肪球膜蛋白质。另外，该课题组分别从人乳、牛乳、山羊乳和牦牛乳等4 种原料中鉴定得到312、554、175、143 种乳脂肪球膜蛋白质组分。Le等[40]采用SDS-PAGE结合LC-MS/MS从牛乳来源的MFGM中鉴定出225 种蛋白质。

Affolter等采用LC-MS/MS结合鸟枪法分别在浓缩乳清蛋白和浓缩酪乳蛋白中鉴定出了244 种和133 种乳脂肪球膜蛋白[41]。不同来源乳中MFGM的蛋白质量分数约为25%～70%[42]，乳脂肪球膜蛋白仅占牛奶总蛋白的1%～4%[43]，Fong等[44]采用质谱等分析方法表征了从MFGM分离的蛋白质和脂质，乳脂肪球膜蛋白质主要有黄嘌呤脱氢酶/氧化酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，XDH/XO）、BTN、脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein，FABP）、血小板糖蛋白4（platelet glycoprotein 4，GP4/CD36）、黏蛋白I（mucin I，MUC1）和高碘酸希夫（lactadherin，PAS）6/7（表1）。次要蛋白质有多聚免疫球蛋白受体蛋白、凝聚素、载脂蛋白E、载脂蛋白A1、乳过氧化物酶、免疫球蛋白重链、71 kDa热休克同源蛋白和肽基脯氨酰异构酶A、肌动蛋白、FABP、分化簇26和MUC等。现有分析技术可以检测出有500多种乳脂肪球膜蛋白[45-46]。这些蛋白质作为外周蛋白松散的吸附在MFGM上，发挥着重要的生物学作用[47]。MFGM及其组分的定性定量方法如图3所示。

图3 MFGM及其组分的定性定量方法Fig.3 Qualitative and quantitative methods for MFGM and its components

表1 乳脂肪球膜蛋白的组成[48-49]Table 1 Composition of proteins in MFGM[48-49]

乳脂肪球膜蛋白在膜上是非对称排列（图4）。FABP对甘油三酯具有高度的亲和性，位于内部的极性脂单分子层。XDH/XO暴露在单分子层的内表面，与BTN和脂肪结合蛋白紧密相连，BTN是MFGM外层的一种跨膜蛋白。另外，这些蛋白质以锚状物的形态形成超分子复合物，在膜的外部和内部相互连接。连同FABP和XDH/XO在内，BTN在维持MFGM稳定性方面具有重要的作用。其他蛋白质，如PAS 6/7位于膜的外围；一些乳脂肪球膜蛋白，如高度糖基化蛋白MUC1，则均匀地分布在外层膜表面[50]。

图4 乳脂肪球膜蛋白排列结构示意图Fig.4 Schematic diagram for the arrangement of proteins in MFGM

3.2 脂肪组成分析

MFGM中的主要脂类物质为极性脂和中性脂。其中的主要极性脂主要分为5 类[51]：PC（19.2%～37.3%）、PE（19.8%～42%）、SM（18%～34.1%）、PI（0.6%～13.6%）和PS（1.9%～16%），其中PC和SM主要位于细胞膜外层，PE、PI和PS集中在磷脂双分子层内部。也有研究报道了分离制备的MFGM脂类的组成（表2），中性脂包含甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯、胆固醇和其他酯类物质，其中甘油三酯是中性脂的主要部分（占总脂的62%）。中性脂在MFGM中的含量有多种报道（56%～80%），其含量很大程度上取决于分离MFGM时使用的分离方法[52]。MFGM中的脂质还有少量的葡糖苷酰鞘氨醇和乳糖酰基鞘氨醇、极少量的溶血PE和溶血卵磷脂。也有研究表明，洗涤过程和离心过程等加工环节都可能使MFGM上SM和外围结合松散的蛋白质有所损失[53-54]。

表2 乳脂肪球膜脂质的组成[54]Table 2 Composition of lipids in MFGM[54]

有研究报道，牛乳中大约60%的磷脂与脂肪球相结合，其余40%磷脂分布于脂肪球膜上，含量丰富的磷脂主要有两性离子形式的PC、卵磷脂、PE和SM[55]，而阴离子形式的PS和PI含量较低。脂肪球膜中的磷脂含有大量长链脂肪酸（C16、C18及C23等），而中链和短链脂肪酸含量较低。脂肪球膜中也存在两种中性鞘糖脂，即约35%的葡萄糖神经酰胺和65%的乳糖神经酰胺[56]。

3.3 糖类组成分析

MFGM中的糖类主要与蛋白或脂质结合在一起，以糖蛋白或糖脂的形式存在。糖脂可分为中性糖脂和酸性糖脂（神经节苷脂）。神经酰胺是通过酰胺键连接到脂肪酸的鞘氨醇。中性糖脂由一个或多个连接到脂质部分中神经酰胺的碳水化合物残基组成，包括半乳糖基神经酰胺、葡萄糖神经酰胺和乳糖神经酰胺等；酸性糖脂由神经酰胺通过糖苷键与至少一个唾液酸和各种其他残基连接的寡糖组成。糖蛋白包括MUC、BTN、脂肪酸转运蛋白（CD36）、乳凝集素PAS 6（52 kDa）和PAS 7（47 kDa）等[57]。

关于MFGM中多糖含量的相关文献报道较少且差异较大。姬晓曦等[58]采用苯酚-硫酸法测定牦牛MFGM中多糖含量约为0.1 mg/g，牛乳、骆驼乳、水牛乳、牦牛乳、山羊乳的MFGM中多糖含量与哺乳动物的品种、分离和分析方法等多个方面相关。

4 乳脂肪球膜的生理功能特性

MFGM中的功效组分多种多样，例如Reinhardt等[59]发现乳脂肪球膜蛋白中，有23%参与了膜/蛋白质运输；11%参与脂肪的转运或代谢；7%参与了蛋白质的合成、结合或折叠；9%载体蛋白、4%免疫蛋白和2%的β-和κ-酪蛋白；剩余21%蛋白的功能未知。这些功能性的发挥主要来自于MFGM中的蛋白质、脂质和糖类组分（图5）[53-54,59]。MFGM中存在的许多蛋白质据报道具有生理功能，如丁基嗜酸蛋白可以抑制多发性硬化症、XO是一种杀菌剂、FABP可以抑制细胞生长、倍他格鲁尿酸酶抑制剂可以抑制结肠癌。根据目前研究报道，MFGM的主要活性包括免疫调节活性、抗肠道炎症活性、抗癌活性、促进细胞生长及分化活性等。

图5 MFGM组分的功能性[53-54,59]Fig.5 Functional properties of MFGM components[53-54,59]

4.1 免疫调节活性

MFGM中的许多成分已被证明有多种营养价值。BTN对人体中枢神经系统疾病有积极影响，BTN与在自闭症儿童血清中检测出的抗体具有序列同源性，可以参与自闭症的免疫调节，正向调节自身免疫性脑脊髓炎，影响自闭症的发病机理。也有研究表明，与食用脱脂乳粉的婴儿相比，以MFGM作为辅食会调节营养不良婴儿的代谢异常，从而改善代谢调节，增强免疫力[60]。

4.2 抗肠道炎症活性

有研究表明，与母乳喂养的婴儿相比，配方乳粉喂养的婴儿在出生后患急性中耳炎、胃肠道感染和呼吸道感染的概率更高，造成这种现象的原因可能与配方乳粉中缺乏MFGM有关[61]；添加MFGM的配方奶粉有助于降低婴儿急性中耳炎的患病率和退烧药使用率，并对肺炎球菌疫苗的体液反应具有免疫调节作用。在另一则报道中，婴儿配方奶粉中添加MFGM可通过促进肠道增殖和分化，提高紧密连接蛋白含量，促进肠黏膜屏障成熟；此外，与喂养配方奶粉相比，添加MFGM的大鼠肠道菌群组成与母乳喂养大鼠的肠道菌群组成更接近。在婴幼儿配方奶粉中添加MFGM可恢复婴幼儿肠道发育，在婴幼儿配方奶粉中添加MFGM能更好地模拟母乳[62]。

近年来，针对乳凝集素对胃肠道保护作用的研究成为热点，乳凝集素可以与各种轮状病毒特异性结合，抑制其复制，减少肠上皮细胞的凋亡从而预防轮状病毒感染而引发胃肠炎。在墨西哥的一项婴儿研究显示，母乳中乳凝集素的含量与婴儿轮状病毒的感染呈负相关。此外，MFGM中的糖蛋白、丁糖苷、乳黏连素和黏液部分在体外具有抗病毒作用，而低聚糖可抑制多种细菌与黏膜的结合[63]，MUC也被证明可以减少小肠结肠炎耶尔森氏菌在肠黏膜上的黏附。

4.3 抗癌活性

在牛、山羊、水牛、牦牛和骆驼5 种动物的乳汁中，山羊乳和水牛乳MFGM在诱导凋亡和降低HT-29细胞活性方面表现出更好的作用[64]。MFGM中的脂质和蛋白质成分对结肠癌、乳腺癌等癌症有一定抑制作用。研究发现MFGM中的FABP在极低的浓度下就可以在体外抑制乳腺癌细胞的生长[65]；神经鞘磷脂可以通过神经酰胺、鞘氨醇和结肠癌细胞的代谢产物诱导癌细胞停止生长、分化和凋亡，可以有效抑制早期和晚期结肠癌；在人乳腺癌细胞中，乳凝集素的表达会降低癌细胞的存活率。因此，MFGM可以作为一种营养补充剂来抑制癌细胞的生长[63]。

4.4 促进细胞生长及分化活性

乳凝集素可以对上皮细胞的生长提供支持，分离纯化后的乳脂肪球膜蛋白可以通过上调蛋白激酶B和mTOR蛋白激酶的表达来有效促进细胞生长并抑制C2C12细胞的凋亡[66]。MFGM对婴儿的疾病预防和生长发育可以起到积极作用。研究证明，在婴儿的饮食中添加MFGM具有一定的预防腹泻作用；对于学龄前儿童而言，饮食中增加MFGM可以改善其语言能力。对于早产婴儿，喂食添加SM强化乳会改善因母乳不足而造成的神经发育缺陷[67]。饮食中的MFGM和乳铁蛋白一起使用不仅更接近母乳的生物活性成分，而且有益于婴儿的认知发育以及消化、呼吸系统的健康[68]。

4.5 其他

近年来，MFGM的成分已被证明具有多种健康益处。MFGM中含有大量活性蛋白及极性脂质，与普通植物油有明显不同。这些活性蛋白对特定疾病状态人群有益。同时乳蛋白与豆类蛋白相比较更易消化。无标记蛋白质组学的基因本体-生物过程注视分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析结果表明，牦牛和奶牛MFGM差异蛋白参与糖脂代谢、免疫调节、抗氧化活性、抗癌、神经调节、抗细菌和病毒黏附等功能[69]。差异蛋白和蛋白质相关基因预测结果均表明牦牛和牛乳脂肪球膜蛋白具有调节糖脂代谢的生物学功能，体外实验证实牦牛和牛乳脂肪球膜蛋白能减少HepG2细胞的脂质积累，增加葡萄糖摄取。牦牛和牛的乳脂肪球膜蛋白分别具有较高的降脂能力和增加葡萄糖摄取的能力，这分别与牦牛和牛不同的葡萄糖和脂类代谢相关的乳脂肪球膜蛋白有关[70]。乳脂肪球膜蛋白已显示出抗病毒活性并降低了腹泻发病率。

5 乳脂肪球膜的理化特性

5.1 乳化特性

MFGM及其各组分都具有两亲性，是优良的乳化剂。研究表明，与使用乳脂肪球膜脂质制备的乳状液相比，用MFGM和乳脂肪球膜蛋白制备的乳状液黏度较低，具有更小的液滴尺寸[71]。热处理结果表明，用MFGM制备的乳液在35～85 ℃下稳定，而用乳脂肪球膜蛋白制备的乳液在温度高于65 ℃时变得不稳定，两者的乳化性能不同[71]。

MFGM的乳化性能与其组成有关，这与制备乳化液选择的原料和MFGM分离方法关系密切。研究发现，通过比较不同乳状液的粒径分布、黏度、稳定性等特性，发现从重组酪乳中通过微滤分离出的富含MFGM的材料具有更好的乳化性能[72]。MFGM乳化特性的发现对食品工业也有很大帮助。β-胡萝卜素在水相中的生物利用度和吸收性较差，在食品工业中的应用收到了极大限制。MFGM可以作为乳化剂与β-胡萝卜素形成乳状液，改善β-胡萝卜素在水中的分散性和稳定性差的问题，从而其提高生物利用度[73]。

5.2 起泡特性和持水特性

由于MFGM和乳脂肪球膜蛋白具有乳化特性，在搅打奶油中添加适量的MFGM和乳脂肪球膜蛋白会使其覆盖脂肪滴而形成聚集的网络结构，从而包裹住搅打过程中掺入的空气，增加了起泡率。在一定时间范围内，搅打时间和起泡率之间呈正相关。有研究表明，超声波处理对乳脂肪球膜蛋白的起泡性影响很大。在低功率条件下处理，乳脂肪球膜蛋白的起泡性呈下降趋势，但起泡稳定性有所提高；在较高超声功率条件下处理时，乳脂肪球膜蛋白的起泡性和泡沫稳定性均得到一定程度的改善，在300 W条件下效果最佳。另有研究发现，MFGM以其较高的持水能力，可以抑制面包芯中水分的损失迁移，从而改善面包老化变硬的问题，也可以作为面包改良剂，增加面包的营养价值，提高面包的品质。

6 结语

目前少有MFGM在乳制品行业的应用。因此，为了理解乳脂肪球的物理、化学和营养特性，针对MFGM各成分的特性研究具有重要意义。MFGM可以被添加到食品中，开发新型营养健康食品[74-75]。例如，添加牛MFGM的婴儿配方奶粉在促进神经发育和抗感染方面显示出非常理想的效果。MFGM中的鞘脂类物质不仅可以治疗和改善心血管疾病，还参与了动脉粥样硬化和胰岛素耐药性的发炎过程。因此可以推断，通过添加MFGM增加食品中鞘脂类物质的含量，相关产品可能具有改善代谢综合征的潜力。此外，MFGM的添加也可能有助于运动障碍综合征的改善。

目前，关于MFGM成分的结构及功能性的研究报道仍然有限，随着MFGM研究的逐步深入，MFGM在食品中的应用研究也将越来越广泛。