食品危害物重组抗体的亲和力提升策略研究进展

王 锋，谢 曦，马路凯，王 琴，肖更生，沈玉栋，徐振林，王 弘,*

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，广东 广州 510225；2.华南农业大学食品学院，广东省食品质量安全重点实验室，广东 广州 510642）

基于抗原-抗体识别的免疫分析方法是可用于食品抽查检测的快速检测技术，其具有操作简单、高特异性、高灵敏度和高通量等优点。抗体作为免疫分析的核心试剂，已被广泛应用于食品中多种危害物的快速检测。目前，基于特异性抗体建立了酶联免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析、电化学免疫分析等多种方法，实现了食品中多种危害物的灵敏、快速和高通量检测[1-4]。包括多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、纳米抗体在内的多样化抗体被大量研发和应用，抗体制备技术经历了从随机非定向制备多克隆抗体到定向制备重组抗体（单链抗体、抗原结合片段（antigen-binding fragment，Fab）抗体、纳米抗体等）的跨越式发展[5-7]。然而，食品危害物不仅包括小分子质量的农药、兽药和生物毒素等，还包括具有大分子特征蛋白的食品致病菌、过敏原等，不同特性的危害物增加了重组抗体制备的难度[8-9]。一些重组抗体对分析物的亲和力较低，限制了其在免疫分析中的应用及其免疫快速检测产品的开发[10]。

抗体亲和力是抗体与抗原之间的特异性结合的能力，体现了两者特异性识别作用的强弱，在目标分析物的定量分析、抗体的进化改造、免疫分析方法的建立及快速检测产品的开发等领域具有重要的研究意义和应用价值[11]。提升重组抗体亲和力可以突破现有重组抗体亲和力不佳的局限性，拓宽原始抗体的生物活性和应用价值。本文概述食品危害物重组抗体的制备技术，从重组抗体突变进化、突变库筛选、多价抗体及融合蛋白自组装等方面阐述重组抗体亲和力的提升策略，探讨重组抗体亲和力提升研究面临的技术瓶颈，并对该领域研究方向进行展望。

1 食品危害物重组抗体的制备技术

食品危害物的重组抗体作为一种已知氨基酸序列的基因工程抗体，主要包括单链抗体、Fab、纳米抗体等，可以通过抗体基因克隆和抗体库筛选两种方式制备（图1）[12-13]。抗体基因克隆技术主要是利用抗体简并引物对目的基因进行扩增，再通过外源表达获得重组抗体；而抗体库筛选技术是以前期构建的抗体库为基础，通过噬菌体展示技术、酵母展示技术、核糖体展示技术等多种策略实现重组抗体的制备[14-15]。与抗体基因克隆技术相比，抗体库筛选技术具有更高的制备效率，获得的重组抗体具有更高的抗原特异性和抗体多样性。以农药、兽药、重金属、生物毒素为代表的小分子类危害物具有较小的分子质量，一般采用动物免疫策略来提高重组抗体制备的有效性，其重组抗体制备存在一定的难度；以食源性致病菌和过敏原为代表的大分子类危害物，其特征蛋白具有多个抗原决定簇，重组抗体的制备较为容易，但针对单个抗原决定簇的抗体不易获得。因此，食品危害物重组抗体的制备技术较为单一，通过上述方式制备的重组抗体存在非定向性和非精准性，一般来说重组抗体亲和力具有很大的提升空间。

图1 食品危害物重组抗体种类及其制备技术Fig.1 Types of and preparation technologies for recombinant antibodies against food hazards

2 食品危害物重组抗体的亲和力提升策略

食品危害物重组抗体的亲和力决定了免疫分析方法检测灵敏度，对于食品危害物的快速检测具有重要意义。作为一种基因工程抗体，食品危害物重组抗体具有结构简单、易于通过基因工程手段进行改造等特点，可以通过重组抗体突变进化、重组抗体突变库筛选、常规多价重组抗体、重组抗体融合蛋白自组装等策略实现重组抗体亲和力的提升（图2）。

图2 重组抗体亲和力提升的几种策略Fig.2 Several strategies for improving the affniity of recombinant antibodies

2.1 重组抗体突变进化提升亲和力

与传统抗体（多克隆抗体、单克隆抗体）相比，重组抗体在分子水平上的突变进化非常简单[16]。重组抗体关键氨基酸位点的鉴定是抗体突变进化的关键，利用抗体同源模建和分子对接技术获得抗体-目标物关键识别位点的定位[17]，进而利用抗体单点突变或多点突变对原始抗体进行改造，实现高亲和力新抗体的制备和突破抗体亲和力不高的限制[18-20]。邓龙等[21]通过同源模建得到克百威农药单链抗体抗体的三维模型，并利用分子对接技术将其与小分子农药进行对接，发现疏水作用和氢键能够极大影响该抗体的亲和力。基于虚拟突变技术确定了关键氨基酸残基重链Arg40和轻链His38及突变氨基酸残基重链Leu40和轻链Leu38，突变后单链抗体亲和力提高了2.23 倍。王方雨等[22]利用同样方法确定新霉素单链抗体的一个关键氨基酸残基为Leu227，并将其突变为Asp227，突变体的灵敏度提高了16.6 倍。He Xin[23]、Wang Jianping[24]和Xie Sanlei[25]等分别将羟氨苄青霉素单链抗体、沙拉沙星单链抗体和金刚烷胺单链抗体的关键氨基酸位点进行突变，提升了这些抗体对11 种青霉素类药物、12 种氟喹诺酮类药物和金刚烷胺的亲和力，基于突变抗体的免疫快速检测方法灵敏度提高了3.9～7.0 倍。链霉亲和素的Fab抗体经过定点突变后，其亲和力提高了6.3～10.7 倍[26]。针对结构更为简单的纳米抗体，其关键位点氨基酸可以影响目标物特异性识别口袋腔的形成及相互作用力，进而影响纳米抗体的亲和力[27-28]。黄曲霉毒素B1纳米抗体的两个关键氨基酸经定点突变后，检测灵敏度分别提高2.3 倍和3.3 倍，并利用核磁共振技术阐述了纳米抗体对黄曲霉毒素B1的特异性识别机制[29]。纳米抗体的晶体结构能够很好地阐释关键氨基酸位点对抗体-抗原特异性结合的重要影响[30-31]。尽管重组抗体的制备存在不确定性，但仍可通过鉴定其关键氨基酸位点并经过抗体的定点突变最终实现重组抗体亲和力的进化提升（图3）。

图3 不同抗体与目标分子的对接模型Fig.3 Docking models of different antibodies and target molecules

2.2 利用重组抗体突变库筛选高亲和力重组抗体

基于重组抗体突变库的抗体亲和力成熟策略主要是利用原始抗体的基因框架，进行突变库的设计合成和高亲和力抗体的制备[32-34]，这样既在一定程度上保证抗体特异性，又可以增加目标物抗体的多样性[35]。重组抗体突变库的高效设计合成是利用重组抗体突变库筛选高亲和力抗体的关键。目前，抗体突变库的设计方法主要有随机突变、饱和突变、NNK突变（N代表4 种核苷酸，K代表核苷酸C/G）、NNY突变（Y代表核苷酸C/T）等，而抗体突变库的设计模式、库容大小、多样性及筛选方法等都会影响高亲和力抗体的筛选（表1）。焦凌霞等[36]首先基于分子对接确定了苏云金芽孢杆菌毒素Bt Cry1Ac单链抗体与5 种Cry1毒素蛋白（Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1E和Cry1F）的共同关键氨基酸位点为Tyr104、Phe105和Tyr107，随后利用三位点共同突变构建了高质量突变库用于高亲和力单链抗体筛选，这与Bt Cry1单链抗体的突变体筛选研究一致[37]。针对苏云金芽孢杆菌毒素Bt Cry1B抗独特型单链抗体与昆虫蛋白BBMV结合能力不高的问题，仲建锋等[38]利用热点氨基酸构建Cry1B抗独特型单链抗体饱和突变库，筛选获得高亲和力突变体Y124G。庞倩等[39]针对黄曲霉毒素B1纳米抗体的CDR2和CDR3区引入部分随机突变，构建了高质量突变库，筛选得到的15 种新纳米抗体中有4 种亲和力有明显提高。吴红静等[40]利用易错聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）并优化了突变条件，构建了突变均衡的纳米抗体随机突变库，筛选获得检测信号提高2.1 倍以上的8 种脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体突变体。陈姣等[41]利用纳米抗体CDR3的NNY突变方式构建了高库容饱和突变库，并分析了突变前后的功能多样性。Qiu Yulou[42]、Chen Feng[43]和Wang Xuerou[44]等利用NNK突变方式分别构建了多样性较高的纳米抗体饱和突变库，筛选得到了针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇模拟抗原、花生过敏原Ara h 3和赭曲霉毒素A的高亲和力纳米抗体突变体。Xu Chongxin等[45]同样利用NNK突变方式将微囊藻毒素MC-LR纳米抗体与重链可变区片段基因融合制备突变库，筛选得到5 种高亲和力的新型双功能重组抗体。基于抗体突变库的高亲和力抗体筛选策略，同时借助噬菌体展示技术、酵母表面展示技术等并结合液相磁珠筛选、荧光筛选等高效淘筛技术，可以避免随机突变的完全非定向性，在一定程度上既保证了抗体的高特异性，又提高了高亲和力抗体筛选的定向性和高效性。

表1 食品中危害物重组抗体突变库的构建及高亲和力抗体筛选的研究进展Table 1 Progress in the construction of recombinant antibody mutation library for hazardous substances in foods and the screening of high-affinity antibodies

2.3 制备常规多价重组抗体提升亲和力

重组抗体结构简单、分子质量较小，通过抗体基因的多价串联或纳米材料修饰方式很容易获得常规的多价抗体（图4），可以有效提高其与抗原的结合能力，也是提高重组抗体亲和力和功能活性的有效手段[46-48]。Yajima等[49]利用连接肽将植物核盘菌的单链抗体基因串联制备二价单链抗体，分析物结合活性提高为原来的2 倍。吴鹏等[50]利用类似方法制备二价纳米抗体用于绵羊肌肉生长抑制素分析。Huang Yunxiang等[51]采用基因串联方式制备了二价、三价和四价纳米抗体用于驼科动物抗体的亲和纯化。He Jinxin等[52]采用串联方式制备四溴双酚A二价和三价生物素化纳米抗体用于细菌磁性颗粒的修饰标记，二价和三价纳米抗体磁性标记物的亲和力分别是单体的3.4、11.4 倍，极大提高了原有纳米抗体的结合活性和分析检测灵敏度；随后，He Jinxin等[53]又利用该策略制备了拟除虫菊酯代谢物3-苯氧基苯甲酸的生物素化三价纳米抗体，并将其应用于生物素-链霉亲和素系统的酶联免疫分析方法的建立，检测灵敏度提高3.6 倍，说明纳米抗体的多价形式可以通过增加其结合能力来提高其与目标物的亲和力。此外，新型纳米材料被广泛用于标记修饰重组抗体来提高抗体亲和力，通过不同的修饰方式可以实现重组抗体的非定向标记和定向标记，且不同材质、粒径、形貌等材料特性均会影响其亲和力[54-57]。

图4 多价重组抗体示意图Fig.4 Schematic diagram of multivalent recombinant antibodies

2.4 重组抗体融合蛋白的自组装作用提升亲和力

尽管常规多价重组抗体的研究已有报道，但利用基因多级串联方式制备多价抗体仍存在表达量较低、生物活性不高、特异性较低等不足。目前，利用特定天然多肽或功能化蛋白制备抗体融合蛋白，进而实现抗体融合蛋白的自组装作用，也是提升原始抗体亲和力的有效策略[48,58-59]。纳米抗体具有结构简单、分子质量小等特性，通过基因重组方式制备多价纳米抗体，有效提高其亲和力和生物活性。以亮氨酸拉链、右手螺旋多肽、软骨寡聚基质蛋白、C4结合蛋白、肠出血性大肠杆菌VT1B亚单位、铁蛋白亚基等为抗体融合蛋白骨架（图5），可以实现重组抗体融合蛋白的自组装多聚体，避免了多价抗体的无序排列和生物活性干扰等[60-66]。Blanco-Toribio[67]、Alvarez-Cienfuegos[68]等利用人胶原蛋白XVIII的三聚域多肽制备获得单链抗体和纳米抗体的三聚体，多聚体生物活性显著提高。武文[69]、张俊毅[70]等分别将脂多糖纳米抗体基因、赭曲霉毒素A纳米抗体基因与VT1B基因融合重组，制备的纳米抗体五聚体能与目标物特异结合，亲和力和生物活性显著提高。Li Zhenfeng[71]、Bao Kunlu[72]等分别将C4结合蛋白与四溴双酚A纳米抗体-纳米荧光素酶双功能蛋白、赭曲霉毒素A纳米抗体基因进一步融合表达，制备得到融合蛋白七聚体，二者方法的灵敏度分别提高7.00 倍和26.54 倍。来源于嗜热古菌的铁蛋白能够自组装成笼型结构的二十四聚体，具有较强的稳定性和亲和力，利用铁蛋白展示多价纳米探针可以显著提高纳米探针的亲和力和生物活性。Wang Feng等[73]将铁蛋白亚基与细交链孢菌酮酸毒素的纳米抗体-纳米荧光素酶双功能蛋白进一步融合表达制备融合蛋白的二十四聚体，检测灵敏度提高了10.5 倍，验证了铁蛋白作为多价抗体骨架展示纳米抗体的有效性。抗体自组装多聚体作为一种亲和力提升新策略，通过对自组装骨架多肽/功能蛋白的优化调控，构建骨架有序集成的抗体多价组装体，可以有效提高抗体的生物活性。

图5 纳米抗体及其融合蛋白的自组装多聚体Fig.5 Nanobody and self-assembled multimers of its fusion proteins

3 食品危害物重组抗体亲和力提升的技术瓶颈

3.1 重组抗体突变及突变库筛选时关键识别位点较难确定

重组抗体的关键氨基酸对抗体亲和力具有重要影响[19,40,44]，因此利用重组抗体突变进化或突变库筛选制备高亲和力重组抗体，需要预先确定抗体特异性识别食品危害物的关键位点，进而对关键识别位点进行定向突变或随机突变。目前，多采用SWISS-MODEL同源模建的方法进行抗体关键识别位点的分析，但该方法存在抗体模板较多、抗体三维结构模型不够精确、分子对接不够准确等缺点；AlphaFold/AlphaFold2是以深度神经网络技术不断优化抗体模型质量，获得的抗体模型具有较高的精准性[74-75]，联合这两种分子模拟技术可以有效提高重组抗体模型的精准度和分子识别机制的准确度。此外，有研究通过蛋白结晶的方法获得重组抗体的晶体结构[31,76-77]，进而确定抗体的关键识别氨基酸，此方法可以显著提高重组抗体突变或突变库筛选的效率和定向性。

3.2 多价重组抗体形式容易影响抗体活性

常规多价抗体和抗体自组装形式均是通过制备多价重组抗体来提高抗体的亲和力，而利用重组抗体修饰纳米材料也可制备获得多价重组抗体。常规多价抗体多采用抗体串联方式，但由于抗体亚基空间结构的交叉及无序排列，在一定程度上会影响多价重组抗体的活性[52-53]。以活性多肽片段等为骨架，可以通过抗体自组装获得多价重组抗体，避免了多个抗体的无序排列，可实现纳米抗体多聚体的自组装[65,78]；但随着重组抗体多聚体的进一步形成，高聚体的生物活性会受到多个抗体亚基的影响，低聚体的生物活性可能会高于多聚体生物活性，这与不同重组抗体的结构有很大关系。尽管利用纳米材料标记重组抗体可以获得多价重组抗体，但常常需要经过特定的化学偶联反应，对抗体的生物活性会产生一定的影响。因此，尽可能采用抗体自组装策略制备多价重组抗体，同时要考虑到重组抗体低聚体和重组抗体高聚体的区别与联系。

3.3 不同危害物或不同类型重组抗体的亲和力提升策略不具有普适性

食品中农药、兽药、重金属、生物毒素、食源性致病菌和过敏原等危害物严重影响着食品营养品质和质量安全。不同食品危害物的重组抗体在蛋白序列同源性和三维空间结构上具有很大的差异，这也会影响抗体的亲和力和检测性能[79-80]。不同危害物的重组抗体具有较高的识别特异性，具体表现为抗体-危害物的结合方式、关键氨基酸、相互作用力等多个方面。此外，单链抗体、Fab抗体和纳米抗体在结构上既有较高相似性也有较大区别之处，这与不同类型重组抗体的生物特性有很大关系。因此，抗体突变进化、突变库筛选、多价抗体及融合蛋白自组装等策略仅可作为重组抗体亲和力提升的可行性依据，对于不同食品危害物或者不同类型的重组抗体要选用多种研究策略进行分析比较。

4 结语

随着现代农业与食品产业的高速发展，食品危害物呈现出种类繁多、污染范围和水平广、检测难度大等特点。基于抗体的免疫检测方法在食品危害物的高通量快速筛查领域有极大的应用前景。重组抗体作为一种特殊形式的基因工程抗体，可以实现抗体基因的突变进化、修饰改造和定向组装。尽管重组抗体的研制具有一定的定向性和高效性，但如何进一步突破其亲和力的限制仍是一个值得探究的科学问题，此外，如何研制高亲和力抗体是食品安全快速检测领域发展的重大需求。

目前，包括抗体突变进化、突变库筛选、多价抗体及融合蛋白自组装等在内的研究策略被应用于提升重组抗体亲和力，但在高亲和力抗体创制的定向性、高效性、便捷性及抗体亲和力与特异性识别机制的关联性等方面还需要不断探索和阐述。以重组抗体晶体结构解析为基础，利用重组抗体突变库结合高效淘筛技术和定向突变技术制备获得高亲和力抗体，并构建重组抗体多价自组装平台，可以实现重组抗体亲和力的多级提升。与单链抗体和Fab抗体相比，纳米抗体作为一种结构更为简单的新型重组抗体，具有较高的热稳定性、有机溶剂耐受性和分析物高特异识别特性，在重组抗体亲和力提升研究中更为便捷，在食品危害物免疫快速检测中有很大的应用前景。此外，包括冷冻电子显微镜技术、现代光谱技术、高分辨质谱技术、X射线晶体衍射技术、非标记生物分子互作技术、AlphaFold/AlphaFold2技术等蛋白质分析及分子模拟技术为重组抗体的虚拟筛选及结构预测提供了极大的便利，为基于结构导向的高亲和力重组抗体的制备提供了新的技术借鉴和研究策略。