肠道菌群在肝细胞癌中的作用及治疗应用的研究进展

殷鼎威 综述 井杰 审校

作者单位：1.中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院血液肿瘤科(杭州 310013);2.海军军医大学第一附属医院实验诊断科

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内最常见的原发性肝癌,发病率在所有恶性肿瘤中排名第六位,死亡率排在所有癌症中的第三位[1]。近年来,随着高通量测序技术在生物医学领域的不断应用,越来越多的研究表明,存在于宿主肠道中的微生物菌群,可通过自身成分、代谢物及移位等,参与宿主细胞的代谢、免疫等局部或全身性生理病理过程,促进宿主癌症的发生发展[2-4]。例如,胰腺导管癌动物模型的肠道真菌可迁移至胰腺,并在胰腺内增殖,影响胰腺癌的恶化进展[5]。改变结直肠癌动物模型的肠道菌群组成会影响结直肠癌的发生发展[6]。近期研究也表明,肠道菌群可通过菌群失衡、肠渗漏和微生物相关分子模式(Microbe-associated molecular patterns,MAMPs)及其代谢产物等方式,进一步以影响肝脏炎症、增强细胞增殖和抑制抗肿瘤免疫等机制来促进HCC的发生发展[7]。本文将介绍肠道菌群与慢性肝病之间的联系,重点阐述肠道菌群在HCC发生发展过程中的作用机制,并探讨基于肠道微生态理论的HCC治疗策略。

1 肠道菌群与肠黏膜屏障

肠道菌群是指寄居在宿主小肠和大肠中的数十万亿个共生细菌和其它微生物的统称[8]。作为复杂而又动态变化的微生物生态系统,寄居在宿主的肠道菌群被认为是一种特殊的“微生物器官”,通过菌群的总数和多样性,以促进食物消化、调节宿主免疫反应和产生多种代谢物等方式来调节宿主代谢平衡[9-10]。当肠道菌群的组成对宿主有益时,菌群和宿主之间的关系称为“共生”。相反,这种有益关系的破坏或菌群与宿主之间的不平衡称为“菌群失衡”。菌群失衡常导致肠黏膜通透性增加,并削弱肠黏膜相关防御功能[11]。

肠黏膜屏障由粘液层、肠上皮细胞和免疫细胞组成,是肠道渗漏物及菌群代谢物进入肝脏的第一道过滤器。已有研究发现多种因素会改变肠黏膜屏障通透性。例如,乙醇对上皮细胞具有毒性,可破坏肠上皮细胞间的紧密连接,致其通透性增强[12-13]。高脂肪饮食(High fat diets,HFDs)可直接或间接加剧肠黏膜屏障损伤。HFDs通过刺激小肠细菌过度生长,增加肠道菌群中肠黏膜屏障破坏物种的数量,增强肠黏膜炎症反应[14]。HFDs还可增强肝脏对胆固醇转变为胆汁酸的代谢,从而影响肠道菌群对胆汁酸的修饰,导致次级胆汁酸水平增加,如产生的脱氧胆酸(Deoxycholic acid,DCA)可通过增强活性氧生成诱导肠黏膜屏障通透性改变[14-15]。通过肠黏膜屏障后,肠道渗漏物及菌群代谢物可通过门静脉转移至肝脏。

2 肠道菌群与慢性肝脏疾病

慢性肝病如慢性乙型肝炎、酒精性肝病(Alcoholic liver disease,ALD)、非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及肝硬化等是HCC发病的重要危险因素[16]。既往研究表明,肠道菌群紊乱和肠道渗透性改变是慢性肝病晚期的共同特征[17-19]。肠道菌群失衡和肠通透性增加可促进MAMPs及微生物有害代谢物,如脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)通过门静脉流入肝窦,从而促发导致肝脏炎症恶化的炎性级联反应[20]。比如,肠道菌群失衡和肠通透性增加造成ALD患者体内LPS水平升高。LPS与Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)结合过度激活Kupffer细胞,继而使机体产生大量炎症细胞因子,导致ALD患者肝脏炎性改变并造成肝损伤[21-22]。对肥胖女性肠道菌群的分子表型特征研究表明,其肠道内产LPS的菌群数量明显增加[23]。此外,产LPS的菌群也被发现在NAFLD患者肠道中可持续富集[24]。动物实验也证实了高脂肪饮食能够增加小鼠肠道通透性,使其门静脉内LPS浓度增加,并通过肝细胞表面Toll样受体介导肝脏炎症,造成NAFLD患者持续性的肝损伤[25]。在慢性肝病发展过程中,肠黏膜屏障受损致使门静脉和全身血液LPS水平升高,高水平LPS进一步活化TLR4/TGF-β介导的肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC),并有助于其过度分泌和沉积胶原等细胞外基质蛋白,导致肝硬化的发生[26]。

3 肠道菌群在HCC中的作用机制

3.1 肠渗漏及MAMPs-Toll样受体促进HCC的发生发展

慢性肝病和HCC发展的各个阶段均存在肠渗漏现象[27],致使MAMPs从肠道漏出,通过门静脉进入肝脏,并通过肝细胞表面受体介导的信号通路促进了HCC的发生发展。LPS是细菌细胞壁的重要组成部分。研究发现在致癌剂诱导的HCC小鼠模型循环血液内可检测到高水平的LPS,长期应用低毒剂量的LPS可显著增加HCC肿瘤的体积和数量[28]。LPS由于肠道渗透性改变进入到血液中,与肝细胞表面TLR4结合。TLR4存在于包括Kupffer细胞、HSC及内皮细胞等在内的多种类型肝细胞中。Dapito等[29]发现非骨髓来源的HSC和肝细胞是LPS的主要靶标,其通过与TLR4结合介导肝细胞再生,从而导致HSC的代偿性增殖。LPS还可通过TLR4促进肝分裂原上皮调节蛋白的表达增加,进而促进肝细胞增殖和抑制肝细胞凋亡。在HCC动物模型中使用抗生素方案减少LPS,或对肝细胞进行TLR4基因敲除,可防止HCC过度增殖,证实了LPS-TLR4轴在HCC发生发展中的重要作用[28]。

3.2 菌群失衡及其代谢产物对HCC发生发展的作用

宏基因组测序揭示了慢性肝病和HCC患者肠道菌群的变化,表现为有害菌的增多,有益菌的减少[30-31]。比如在肝硬化患者中,表现为肠杆菌科及奈瑟菌科等有害菌增加,而乳杆菌、双歧杆菌等有益菌却显著减少[32]。肠道菌群失衡可通过肠道菌群的有害代谢产物来影响HCC[33]。在NASH诱导的HCC中[27],肠道革兰氏阳性菌尤其是梭菌属数量增加,导致血液中的细菌代谢物DCA合成增多。DCA主要是通过肠肝循环引起HSC中的促进衰老相关的分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype,SASP)的产生,进而在肝脏中分泌各种炎症和促肿瘤因子,促进NASH相关的HCC发展。在抑制细菌的7-α羟化酶后,胆汁酸代谢(7-α位脱羟基)为DCA受到限制,DCA血清水平降低,NASH相关的HCC的恶性进展得到了缓解。进一步研究表明,DCA主要通过激活mTOR信号通路诱导NASH相关的HCC发展[34]。除DCA外,肠道细菌代谢产物如短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)不仅能够为肠上皮细胞提供能量来源,而且可以改变肠黏膜通透性,导致肠道有害渗漏增多,从而促进HCC的发展[35]。

3.3 肠道菌群调节肿瘤微环境影响HCC的发生发展

肠道菌群会影响肿瘤微环境,进而促进HCC的发展。Ma等[36]发现肠道菌群是抗肿瘤免疫的重要调节者,其使用胆汁酸作为信使来调节肝窦内皮细胞上趋化因子CXCL16[Chemokine(C-X-C motif)Ligand 16,CXCL16]水平,从而控制趋化因子CXCL16依赖的肝自然杀伤T细胞(Natural killer T cells,NKT)积聚,积聚的NKT细胞具有激活的表型并抑制肝肿瘤的生长。因此,通过抗生素治疗去除革兰氏阳性细菌(含有将初级胆汁酸向次级胆汁酸转化的细菌),相应的次级胆汁酸减少和初级胆汁酸增加,有效诱导了肝脏NKT细胞积累,导致肝细胞抗肿瘤免疫增强及肝肿瘤生长减缓[36]。进行胆汁酸代谢细菌定植或补充次胆汁酸也可逆转NKT细胞的积聚,改变肠道共生细菌对肝肿瘤生长的抑制[36]。此外,肠道菌群失调也会刺激肠上皮细胞特别是簇细胞分泌大量的白介素25(Intedeukin-25,IL-25)。IL-25能够活化肝脏M2型巨噬细胞并分泌趋化因子CXCL10[Chemokine(C-X-C motif)Ligand 10,CXCL10],激活上皮间充质转化途径,促进HCC的形成、侵袭和迁移[37]。

4 肠道菌群作为HCC治疗靶点的应用前景

4.1 抗生素

抗生素治疗主要是通过减少肠道内细菌总数,减少细菌易位,从而抑制来自肠渗漏引起促炎信号的激活。比如,晚期肝硬化患者长期口服诺氟沙星能有效减少患者小肠细菌过度生长和细菌易位,降低自发性细菌性腹膜炎和肝肾综合征1年再发生的概率,提高患者生存率[38]。Gangarapu等[39]发现NAFLD尤其是NASH患者短期给药利福昔明,可抑制患者内毒素促炎细胞因子的产生。有研究发现通过氨苄西林、新霉素、甲硝唑和万古霉素组成的口服抗生素组合持续灭菌肠道,可有效减少DEN/CCl4诱导小鼠HCC肿瘤的数量和体积[29]。然而,大部分研究结果并不能直接转化为患者的治疗方案,因为长期联合抗生素(如新霉素等肾毒性药物)治疗对患者有害,尤其是肠道内的共生菌群可能由于长期用药被消耗殆尽。此外,抗生素预防和治疗HCC可能是长期、甚至终生过程。在HCC患者中如何使用安全性高的抗生素还有待临床实验研究。

4.2 TLR4拮抗剂

肠道菌群刺激肝细胞表面的TLR4活化、促进HCC发展是慢性肝损伤、炎症和纤维化的长期结果。TLR4途径在慢性肝病和HCC发生过程中作为肠道菌群通过肠-肝轴促进HCC发展的中介物起着关键作用,运用TLR4的拮抗剂可以为治疗HCC提供新策略[28]。目前,已开发多种TLR4拮抗剂[40],包括结合LPS类、拮抗CD14—LPS结合的相互作用类、拮抗LPS—MD2—TLR4相互作用类、直接靶向TLR4类、抑制TLR4活性类等。到目前为止,这些药物均未在慢性肝病及HCC患者的临床实验中进行过测试。主要是由于长期抑制TLR4可能导致免疫抑制,造成慢性肝病及HCC患者的免疫功能严重受损。因此,需要对TLR4拮抗剂的安全性进行仔细评估,然后才能开展其对预防和治疗慢性肝病及HCC长期疗效的研究。

4.3 益生菌

益生菌对肠道菌群的调控可能为治疗或预防HCC发展提供一种新的途径。使用益生菌有助于恢复肠道菌群组成、改善肠道屏障功能,从而减轻肠道-肝脏炎症和抑制HCC发展[41]。Li等[42]发现HCC小鼠给予益生菌喂养,显著减缓了HCC的进展,同时肿瘤的体积和重量均减少了40%。在DEN诱导的小鼠HCC发生过程中,食用高剂量的益生菌混合物可重塑肠道菌群的特定区域,抑制革兰氏阴性菌的生长,进而改善肠道屏障完整性及减轻肠道炎症,改善慢性肝脏炎症和抑制肿瘤生长[43]。Elshaer等[44]发现硫代乙酰胺诱导Wistar大鼠发生肝硬化是通过激活TLR4/CXCL9/PREX-2通路。早期给予植物乳杆菌干预,可以显著抑制大鼠肝细胞TLR4、CXCL9和PREX-2表达,从而预防肝硬化向HCC进展。总的来说,尽管益生菌在动物模型中的治疗效果良好,但仍需设计良好、大规模和强有力的临床研究来支持益生菌可用于治疗人类慢性肝病及HCC。

4.4 粪便菌群移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)

FMT是一种将从正常供体获得的粪便溶液移植到受体肠道的过程,以直接改变受体肠道的菌群组成,并调节受体的健康或治疗某种疾病[45]。FMT已用于治疗复发性艰难梭菌十二指肠感染,实现了比标准抗生素治疗更好的临床改善效果[46-47]。目前,FMT已被证明在通过免疫检查点抑制剂疗法治疗的癌症类型如结直肠癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤等具有良好疗效[48-49]。同样的,FMT增强了免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用,为HCC的预防与治疗提供了潜在策略。尽管FMT具有抗肿瘤的应用前景,但这一过程由于整个肠道菌群与治疗菌群一起转移而缺乏有效控制。因此,仔细评估捐赠者的健康及控制其肠道菌群特异性组成至关重要。此外,仍需大量的临床实验数据来支持这一疗法应用的有效性和安全性。

5 小结与展望

肠道菌群在HCC中的作用机制研究主要集中在三个方面。一方面,在慢性肝病进展过程中,肠黏膜屏障破坏及肠道菌群生态失衡造成了肠渗漏增加。肠道渗漏物如LPS会通过MAMPs-TLR轴激活炎症性的肝细胞表面TLR4,进而促进肝细胞增殖及抑制肝细胞凋亡导致HCC的发生发展;另一方面,肠道菌群失衡产生的一些毒性代谢产物如DCA及SCFAs等也可增加HCC发生发展的风险;最后,肠道菌群通过调节多种信号分子,影响肝细胞的肿瘤微环境,进而促进HCC的发展。这些致癌机制的研究提示可通过靶向肠道菌群,如使用抗生素、TLR拮抗剂及益生菌等,为HCC的治疗提供新的策略。目前,肠道菌群与HCC关系的研究仍有亟待解决的问题。研究人员仍然缺乏对不同菌群在HCC发生发展过程中的个体效应及其对疾病进展的具体贡献的详细了解,包括不同菌群如何调节肠黏膜通透性、通过衍生物直接影响肝脏炎症及肿瘤微环境等。其次,基于肠道菌群的HCC治疗策略大部分都应用于动物模型,缺乏相关转化医学的研究以支持其可有效应用于人体的临床治疗。未来,针对不同菌群的功能分析、机制研究、相关转化医学研究是将基于肠道微生态理论的HCC治疗策略从临床前模型转化为临床应用的关键,最终设计针对疾病不同阶段肠道菌群特定的治疗方法,以治疗慢性肝病,减缓肝硬化和抑制HCC的发生发展。