磷脂酶A2在肝细胞癌发生发展过程中的作用

李飞燕 张日云 王娜 王明刚 毛德文

1广西中医药大学研究生院（南宁 530200）；广西中医药大学第一附属医院 2肝病科，3科研部 （南宁 530023）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界癌症相关死亡的第四大原因［1］。根据2020年全球癌症人数统计结果显示［2］，全球每年大约有60 万HCC的新发病例，HCC 的死亡人数在50 万左右。而我国的新发病例就占据了全球的47%［3］。HCC的发病与肝脏持续的应激源有关，主要是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染，病毒感染导致肝硬化及HCC。HCC 同时也是肝硬化患者死亡的主要原因［4］。全世界约有2.96 亿人口感染HBV，其中，我国有8 600万乙肝病毒携带者，3 200万慢性乙型肝炎患者［5‑6］。庞大的乙肝病毒感染基数，给HCC的发展带来了潜在的风险。从乙肝到HCC 主要经历三步：肝炎→肝硬化→HCC。HBV 进入机体后，机体通过免疫反应清除病毒的同时，也导致肝细胞损伤，从而引发肝脏炎症的发生。肝细胞损伤后进行自我修复，肝脏以瘢痕化、纤维化出现，使肝脏失去应有的柔软、弹性，质地逐渐变硬，进而发展为肝硬化。HBV 与HCV 的主要治疗手段有：疫苗接种、抗病毒治疗［7］。尽管我国实施了疫苗接种计划多年，在一定程度上减少HBV 和HCV 的感染，但由于人口众多，HBV 和HCV 感染的绝对数量仍然很高。慢性乙型肝炎的最佳治疗终点是乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）血清清除，即使进行了HBsAg 血清清除，也仍然存在转变为HCC 的风险［8］。

高发病率、高病死率、低生存率是HCC 在我国流行病学上呈现出的基本特征。数据结果显示［9］，HCC 患者预后差，5 年生存率仅13%左右。HCC 发病与吸烟、酒精、咖啡、饮食等因素有关［10］。HCC 生长受到多种因素影响，其中包括表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），这些生长因子通过细胞内信号途径促进血管生成和细胞增殖［11］。在过去的30 年里，随着抗病毒治疗的实施，虽然我国HBV 和HCV 引起的HCC 已经有所下降，但是抑制病毒复制并不能根除病毒，因此HCC 的发展仍在持续进行中［12］。HCC 的治疗方式为：手术治疗、放射治疗和免疫疗法［13］。手术后的复发风险高，且多数患者在就诊时已错过最佳手术时机。免疫治疗作为HCC 治疗的一个重要方法，其在患者间疗效有很大的差异，治疗费用高，给临床治疗带来了很大的挑战［9］。因此，深入研究HCC 形成与发展的分子机制，寻找新的干预靶点或治疗手段仍迫在眉睫。

新近研究发现，磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）积极参与了HCC 形成与发展过程，其能催化磷脂sn‑2位酰基水解。按酶的特性与结构PLA2可以分为三大类：分泌型磷脂酶A2（secretory phos‑pholipase，sPLA2）、胞质型磷脂酶（cytosolipase，cPLA2）和钙非依赖型（Ca2+‑independent phospholi‑phone，iPLA2）［14］。PLA2 广泛存在于哺乳动物体内，对许多细胞反应起着重要的影响，并参与磷脂的消化代谢，免疫防御和信号传导等一系列复杂的进程。激活PLA2 可产生花生四烯酸（arachi‑donic acid，AA）级联反应，具有诱导肝癌细胞存活、增殖、凋亡、转化和转移等一系列作用。PLA2与HCC 的发病有广泛的关联，故深入探讨PLA2 发病中HCC 的病理机制有十分重要的意义。本文总结了PLA2 对HCC 进展的作用特点，以期为HCC药物研发及临床防治工作提供新思路及药物靶点。

1 PLA2 的亚型及其功能特点

1.1 sPLA2 的特性及基本功能特点sPLA2 可切割sn‑2 位上的酯键以产生溶血磷脂（lysophospho‑lipid，LPL）和游离脂肪酸（free fatty acid，FA）。PLA2 中释放出的脂肪酸包括单不饱和脂肪酸（mono‑unsaturated fatty acids，MUFA）以及多不饱和脂肪酸类（poly‑unsatulas，PUFA），例如AA，二十碳五烯酸（eicosapentaenoic Acids，EPA）二十二碳六烯酸（docosahexaenoic，DHA）等，这些脂肪酸可进一步转化成脂质介质中具有生物活性的脂质代谢物并发挥激素样分子信号作用［15］。sPLA2 根据其主要结构被细分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类。ⅡA型分泌型磷脂酶A2（type ⅡA secreted phospholi‑pase A2，sPLA2‑ⅡA）能够作用于内源性底物，如线粒体和细胞外囊泡，并在炎症或组织损伤期间从宿主细胞释放。与宿主免疫其他分子一样，sPLA2‑ⅡA 具有双向调节作用。在受到病原体感染时，sPLA2‑ⅡA 比其他分子低的含量时就已经可以起到抗菌作用。磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl‑serine，PS）暴露可导致血栓前状态，这一状态往往与严重的炎症诱导疾病相关。sPLA2 能有效地水解PS 暴露（凋亡）细胞，反过来又会在环境中释放脂质分解产物。与正常细胞相比，PS暴露膜在钙依赖过程中被sPLA2 快速分解，不管触发因素如何，升高sPLA2水平表明强烈的持续性炎症信号［16］。研究显示［17］，sPLA2 可通过引起肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）‑α 生成，释放细胞色素c而发挥其凋亡活性。以上证据说明，sPLA2 具有参与炎症反应及诱导细胞凋亡的作用。

1.2 cPLA2 的特性及基本功能特点除cPLA2γ外，所有cPLA2 酶的N 端均含有钙依赖性脂质结合结构域，需要微摩尔水平钙离子才能充分发挥酶活性［15］。对于cPLA2α 来说，在受到细胞外刺激下，cPLA2α 被激活，活化的cPLA2α 催化AA 从膜磷脂（membrane phospholipids，PLs）中释放，进而导致脂质介质前列腺素（prostaglandins，PGs）、白三烯（leukotrienes，LTs）和血小板活化因子（platelet‑activating factor，PAF）的产生。cPLA2γ 不含C2 结构域，其活性不需要钙离子，活化后的cPLA2γ 在C 末端附近法尼化，组成膜结合。这种非典型cPLA2 亚型通过iPLA2、溶血磷脂酶和转酰酶（以CoA 非依赖方式将脂肪酸从一种磷脂转移到另一种磷脂）活性参与PLs 重塑。cPLA2γ 的活性可能与肝细胞中的脂滴生成有关，因为它的敲除可减少HCV 病毒感染后的脂滴形成，而它的腺病毒过度表达促进了高脂饮食小鼠肝脏中脂滴形成和脂肪积累［18］。因此，cPLA2参与肝脏炎症反应。

1.3 iPLA2 的特性及基本功能特点iPLA2 是一种不依赖Ca2＋的酶［19］。iPLA2 主要是作为脂肪酶发挥作用。iPLA2β 是一种分子量约85 kDa 的细胞溶质蛋白，其催化结构域中有丝氨酸脂肪酶共有序列（GTSGT）。iPLA2β 主要通过生成LPL 受体，该受体结合脂肪酸参与PLs 维持［20］。iPLA2β 激活可产生多种具有生物活性的脂质介质有明显促炎作用。iPLA2 γ 基因分布在染色体7q31 上，cDNA编码含782 种氨基酸、分子量90 kDa 蛋白质［20］。iPLA2γ 基因转录普遍存在。iPLA2γ 与iPLA2β 一样，通过生成LPL 受体参与PLs 的维持。iPLA2γ与细胞的死亡有关，开启线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是诱导线粒体介导的细胞死亡的首要步骤。iPLA2γ定位于内质网以及线粒体和过氧化物酶体中，内质网iPLA2β 参与细胞对氧化应激的保护，iPLA2γ 的缺失会导致线粒体结构异常。研究表明［21］，肝脏过氧化物酶体膜高度富集AA。iPLA2γ也参与脂质介质生成，通过线粒体Ca2+诱导iPLA2γ活化释放AA 随后被氧化形成多个下游类花生酸，如脂氧合酶产生的羟基二十四碳烯酸、环氧化酶（cyclooxygenases，COX）产生的PGs 和细胞色素P450s产生环氧二十碳三烯酸［22］。上述说明，iPLA2参与维持线粒体完整性、磷脂重塑、防治氧化应激、脂质介质生物合成及细胞死亡［23］。

2 PLA2 与HCC

2.1 sPLA2与HCCsPLA2分子量大约在14 kDa，它需要亚毫摩尔至毫摩尔浓度Ca2＋激活，以在8.0～9.0最佳pH值下有效水解底物磷脂［24］。sPLA2水解细菌和病毒膜产生AA，进而释放多种生物活性脂质介质，包括PGs、血栓素、LTs 和脂蛋白，这些分子具有强大多性效用，可以调节炎症反应。AA作为一种PLA2代谢物，可介导健康和病理状态下多种细胞机制，如血小板聚集、淋巴细胞活化和组织炎症。AA 可以通过调节Ca2+选择性通道激活Ca2+进入，从而减少细胞增殖和迁移，同时通过凋亡诱导细胞死亡，可起到抗肿瘤作用［25］。sPLA2通过核因子κB（nuclearfactor‑kappa B，NF‑κB）的激活对癌细胞增殖发挥作用，抑制sPLA2 可减弱癌细胞NF‑κB 活性，减少细胞增殖并促进细胞凋亡。AA 能通过环氧合酶和5‑脂氧合酶途径进一步在细胞内代谢并分别生成促炎介质如PGs、LTs等，它们能激发TNF‑α 和白细胞介素（interleukin，IL）‑1 等炎症细胞因子的产生增强sPLA2 自身表达，导致炎症事件的信号放大和加剧。研究显示［26］，炎症性疾病、癌症中存在高水平sPLA2 表达，局部和全身炎症都与体内sPLA2 的释放有关，此外，IL‑1β、IL‑6 和TNF‑α 等促炎因子在多种组织中诱导sPLA2 基因转录并随后增加其分泌。炎症因子TNF‑α 和IL‑1，还可以间接诱导人肝癌细胞和肝细胞中sPLA2‑ⅡA 表达。在炎症发作期间，人类肝癌细胞在对包括TNF‑α、IL‑1 和IL‑6 在内的各种趋化因子的反应中释放出sPLA2 ⅡA，sPLA2 ⅡA 的水平也与吞噬作用和中性粒细胞功能改变密切相关，即释放超氧物、趋化性和溶酶体酶［27］。因此，sPLA2 参与HCC 发展进程中炎症反应、细胞增殖及调亡进程。

2.2 cPLA2与HCCcPLA2的分子量约在85 kDa［14］。cPLA2α 在细胞活化后，从核周膜室的磷脂中选择性地释放AA，AA 通过环氧合酶和末端PG 合成酶对PG的顺序作用（COX途径）或5‑脂肪氧化酶和末端LT合成酶向LT的顺序作用进行代谢［18］。在肝癌中，转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF‑β）通过p38 MAPK（mitogen activated protein kinases，MAPK）和ERK1/2 介导激活cPLA2α 磷酸化。研究表明［28］，肝癌细胞中cPLA2α 的过度表达可阻止TGF‑β1 诱导生长抑制，cPLA2α 过度表达可阻止TGF‑β1 诱导的Hep3B 细胞caspase‑3 裂解，cPLA2a 在预防TGF‑α 诱导凋亡中起作用。AA 分泌二十碳六烯酸通过自分泌作用激活G 蛋白偶联受体（G protein‑coupled receptor，GPCR）介导的信号通路，促进TNF‑α 转录、合成和释放，进而诱导NF‑κB 依赖性基因表达。此外，NF‑κB 核移位可增强cPLA2 的表达；反过来，cPLA2 过度表达进一步增加AA 的释放，并增强二十烷酸介导的促肿瘤作用（癌细胞存活、增殖、凋亡抵抗、转化和转移）［29］。PGE2属于PG，主要是通过它分别以自分泌或者旁分泌机制作用于EC 表面或者肿瘤细胞上，GPCR中E‑PGs 2/4亚型而激发VEGF。TGF‑β 是肝脏生理病理的关键调控因子，它参与肝脏疾病从肝炎、肝纤维化到肝硬化和HCC 的发展过程。在HCC 中，TGF‑β 激活cPLA2α 磷酸化，一方面导致AA 产生PGE2 并促进细胞生长，另一方面激活过氧化物酶体增殖物激活受体‑γ（peroxisome prolif‑erator‑activated receptor‑γ，PPAR‑γ），从而抵消smad 2/3 依赖性TGF‑β 信号通路介导的细胞增殖抑制［29］。因此，激活cPLA2 能促进HCC 进展。

2.3 iPLA2 与HCCiPLA2 分子量范围在28～146 kDa［19］。iPLA2β 蛋白含有1 个caspase 3 裂解位点（DVTD）和一个假定双核定位序列（KREF‑GEHTKMTDVKKPK），并且该蛋白在受到刺激后，可以与多个亚细胞定位蛋白结合，并动员到高尔基体、内质网（endoplasmic reticulum，ER）、线粒体和细胞核等亚细胞器。ER 调节蛋白质内稳态，称为蛋白质稳态，蛋白质稳态就是对细胞器及细胞外空间中蛋白质生物的发生，折叠，装配，转运等过程进行监控［30］。出现缺氧、未折叠蛋白聚集、能量匮乏和其他刺激因素可导致内质网应激［31］。ER 应激可导致细胞存活、凋亡、增殖及分化，ER应激与许炎症疾病、癌症等疾病相关［30］。研究［32］表明，iPLA2β 的增加会强化ER 应激并增强细胞凋亡，通过抑制iPLA2β 可改善ER 应激并减少细胞死亡。iPLA2β 在C 端半部包含脂肪酶共有序列Gly‑X‑Ser‑X‑Gly，以及围绕该基序的几个片段，与iPLA2β、cPLA2 和patatin 的催化结构域同源。iPLA2β 包含8 个N 端锚蛋白重复序列、1 个ATP 结合盒（GGGVKG）、1 个caspase‑3 裂解位点（DVDT）和2 个钙调蛋白（CAM），iPLA2 β 激活可导致膜甘油磷脂中sn‑2 脂肪酸替代基被水解产生游离脂肪酸，如AA、EPA、DHA 及2‑LPL 等，AA 之后经环氧合酶、脂氧合酶等通路被代谢掉，导致产生生物活性氧化类二十碳六烯酸，并被认为是炎症疾病的促因。二十碳烯酸有助于炎症和自身免疫疾病［33］。AA 在环氧合酶、脂氧合酶的作用下代谢成各种化合物，这些化合物多数已知能诱导细胞生长及EGF 受体和MAPK 的活化。LPL 可被溶血磷脂酶D 代谢形成溶血磷脂酸。抑制PLA2 会改变AA 和LPA 的释放，这可能会降低EGFR 和MAPK基础激活，以及GPCR 途径抑制剂降低癌细胞生长能力。研究［34］发现，过氧化物酶6（Peroxiredoxin 6，PRDX6）能诱导HCC 细胞的S 期停滞并且抑制HCC 的癌变，而PRDX6 的iPLA 活性促进了TNF‑α的癌细胞死亡。研究［35］表明，肝iPLA2β 在细胞氧化脂质代谢和肝细胞死亡中的作用不同，肝脏iPLA2γ 可以减少有害氧化AA 代谢物产生，iPLA2γ的缺失减弱肝细胞中的细胞毒性。因此，iPLA2 激活参与HCC 肝癌细胞存活、增殖、凋亡、转化和转移等过程。

3 展望

综上所述，就目前来说，HCC 的治疗对医务人员来说仍然是一个巨大的挑战。PLA2 与HCC 之间存在着紧密联系，可考虑将PLA2 作为HCC 潜在的治疗靶点。研究证实，激活PLA2 会加快HCC 进展，或许可以通过开发抑制PLA2 相关的药物来阻断HCC 的发展，提高HCC 患者的生存率。PLA2参与肝脏炎症过程，可以考虑将PLA2 相关药物应用于肝脏疾病早期，从而减缓肝炎反应强度，阻断甚或逆转肝纤维化进程，减少HCC 发病。激活PLA2 会引发AA 级联反应，或许通过抑制PLA2介导的AA 级联反应可作为治疗HCC 药物靶点。PLA2 在炎症、肝脏疾病中扮演重要角色，可进一步阐明它们之间作用机制，将PLA2 应用到其他肝脏疾病治疗中。但想要将其应用到临床实践中，仍有许多困难需要去跨越：（1）PLA2 与HCC 之间相关基础研究较少，两者之间作用机制尚未完全清晰，深入探索他们之间具体分子机制，可为临床奠定坚实理论基础；（2）PLA2 研究主要集中在iPLA2，而对于cPLA2 的相关研究较少，需要加大对cPLA2 研究工作，以明确cPLA2 更多生理功能及其在HCC 形成与发展中发挥的生物学效应；（3）目前的基础研究工作大多停留在动物研究上，而人体研究数据相对较少，需要挖掘更多的人体研究数据，才能更接近临床实际。