PICU重症肺炎患儿纤维支气管镜肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9表达及其临床意义

姜家利 陈婷 童文佳 丁洁 徐卫华

安徽省儿童医院儿科（合肥 230001）

儿科重症监护病房（pediatric intensive care unit，PICU）重症肺炎具有发病率高、病变进展快的特点［1‑2］。重症肺炎不仅可进展为肺不张、坏死性肺炎等严重疾病，还可诱发肺外并发症，造成多组织器官功能障碍［3-4］。纤维支气管镜肺泡灌洗术是临床治疗PICU 重症肺炎患儿常用的方法，可清除患儿肺部痰液，阻止肺内分泌物堆积，有效控制肺部感染，但不同PICU 重症肺炎患儿治疗疗效具有明显差异［5］。早期评估PICU 重症肺炎患儿纤维支气管镜肺泡灌洗术后治疗转归情况，可指导临床早期及时调整医疗方案，改善患儿预后。目前国内外研究［6-7］指出，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B 信号通路是调节细胞生长、增殖、运动、代谢和存活的核心信号通路之一，参与肺部感染炎性反应过程，与肺炎发生、病情进展有关的炎症级联反应关系密切，抑制该信号通路途径可促进自噬反应。基质金属蛋白酶-9（matrix metal‑loproteinase 9，MMP-9）是含锌内肽酶家族成员之一，可降解细胞外基质蛋白，损坏呼吸系统结构，在炎性反应造成的呼吸系统结构改变中具有重要作用［8］。笔者推测PICU 重症肺炎患儿纤维支气管镜肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表达与患儿病情、预后有关，但目前尚缺乏其关系验证的有关报道。明确PICU 重症肺炎患儿纤维支气管镜肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表达与预后的关系，可能为临床治疗重症肺炎提供更多新的靶点方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2021 年1 月到2022 年6 月医院PICU 收治的103 例重症肺炎患儿为研究对象，其中男53 例，女50 例，年龄6 个月至6 岁，平均（4.19±0.53）岁。本研究经医院伦理委员会审批（编号：EYLL-2019-013）。纳入标准：（1）符合《中国急诊重症肺炎临床实践专家共识》［9］中重症肺炎诊断标准，即符合至少1 项主要标准：需机械通气，体液复苏后仍需血管活性药物；或满足至少3 项次要标准：发热，呼吸频率≥ 50 次/min，动脉血氧分压/吸入氧浓度< 250 mmHg，影像学检查显示多肺叶浸润，出现意识障碍，血尿素氮≥ 7 mmol/L，低血压且需液体复苏；（2）预计生存时间> 3 d；（3）入院前未接受相关治疗者；（4）患儿监护人签署研究知情同意书。

排除标准：（1）入住PICU 24 h 内死亡者；（2）长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂、免疫增强剂等药物者；（3）入院治疗前已行机械通气、气管切开者；（4）伴先天性发育异常、先天性心脏病等疾病者；（5）伴肺结核、支气管肺炎、肺纤维化、间质性肺部疾病、呼吸衰竭者；（6）伴免疫系统疾病者；（7）无法配合完成本研究者；（8）家属放弃治疗者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方案所有患儿入院后参照《中国急诊重症肺炎临床实践专家共识》［9］，依据个体情况给予抗感染（根据病原菌测定结果给予万古霉素、美罗培南抗菌治疗）、机械通气、补液支持治疗、血管活性药物维持循环、营养支持、纤维支气管镜肺泡灌洗术等对症治疗。

1.2.2 纤维支气管镜肺泡灌洗术所有研究对象均经纤维支气管镜肺泡灌洗（采用0.9%氯化钠溶液，灌洗量1 mL/kg），术前常规禁食、禁饮，鼻咽部局部麻醉采用1%利多卡因，静脉镇静使用咪达唑仑，监测血压等生命体征，仰卧位，通过鼻腔单侧置入纤维支气管镜，观察并确定病变区域，送检气管、支气管与鼻咽位置分泌物，调整负压多次灌洗氯化钠溶液，灌洗结束后，在感染病变支气管内注入5～10 mL 敏感抗生素（生理盐水稀释），多次灌洗后吸出灌洗液，术后禁食2 h。

1.2.3 纤维支气管镜肺泡灌洗液中PI3K、MMP⁃9测定术后离心分离肺泡灌洗液（转速3 500 r/min，离心时间15 min，离心半径10 cm），采用酶联免疫吸附法测定肺泡灌洗液中MMP-9 水平，试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）测定PI3K 表达情况，Trizol 裂解液提取总RNA，逆转录试剂盒（德国Qiagen 公司）逆转录成cDNA，以cDNA 为模板进行qRT-PCR，反应体系：cDNA 1 μL、正反向引物各0.5 μL、PCR 缓冲液10 μL、蒸馏水8 μL，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸5 min，共35个循环。内参用GAPDH（正向：5'-ACG‑GCTGCCTGGTCTGGTCCGCCG-3'，反向：5'-GCTG‑GCTGGCGGCGTGCCGGGC-3'），2-ΔΔCt法计算PI3K（正向：5'-AGCCGGTCCCGGGTCGGGTCTGCGG-3'，反向：5'-GTTGCCTGGGCGTCGTGTCCGCC-3'）mRNA相对表达量。

1.2.4 收集资料收集所有患儿基本资料及纤维支气管镜肺泡灌洗术后的指标，包括性别、年龄、身高、体质量、喂养方式、体温、是否休克、是否伴并发症，入住重症监护室48 h 内的儿童危重病例评分（pediatric critical illness score，PCIS）［10］、儿童器官功能障碍2（pediatric logistic organ dysfunction-2，PELOD-2）评分［11］，纤维支气管镜肺泡灌洗术后心率、呼吸频率、平均动脉压、氧合指数、血小板（platelets，PLT）计数、血红蛋白、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、血清丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（as‑partate aminotransferase，AST）、白细胞（white blood cell，WBC）计数、机械通气时间、PICU 停留时间及肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 水平、肺泡灌洗治疗药物（万古霉素、美罗培南）。

1.2.5 患儿预后情况评价方法患儿入院后随访21 d，参照《中国急诊重症肺炎临床实践专家共识》［9］评价预后情况，将患儿治疗后发热、呼吸困难等体征基本消失或明显好转，胸部X 线显示肺部病灶基本吸收，生存良好记为预后良好，否则记为预后不良。

1.3 统计学方法数据处理采用SPSS 18.0 统计软件，计量资料以均数±标准差表示，比较采用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较做χ2检验；相关分析用Pearson 法；绘制ROC 曲线；影响因素的分析采用logistic 回归分析模型。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PICU 重症肺炎患儿近期预后情况103 例PICU 重症肺炎患儿随访期间预后不良29 例（28.16%），其余74 例（71.84%）预后良好。

2.2 PICU 重症肺炎患儿预后不良组及预后良好组基本资料预后不良组及预后良好组患儿的性别、年龄、身高、体质量、喂养方式、体温、心率、呼吸频率、平均动脉压、PLT、血红蛋白、FIB、ALT、AST、WBC、重症监护室停留时间、肺泡灌洗治疗药物对比，差异均无统计学意义（P> 0.05）；预后不良组的合并休克占比、伴并发症占比、PELOD-2评分、机械通气时间、PI3K mRNA 相对表达量、MMP-9 水平均高于预后良好组（P< 0.05），预后不良组的PCIS 评分、氧合指数均低于预后良好组（P< 0.05）。见表1。

表1 PICU 重症肺炎患儿预后不良组及预后良好组基本资料比较Tab.1 Comparison of basic data between poor prognosis group and good prognosis group of PICU children with severe pneumonia ±s

表1 PICU 重症肺炎患儿预后不良组及预后良好组基本资料比较Tab.1 Comparison of basic data between poor prognosis group and good prognosis group of PICU children with severe pneumonia ±s

因素性别［例（%）］女男年龄（岁）身高（cm）体质量（kg）喂养方式［例（%）］母乳喂养奶源喂养混合喂养体温（℃）合并休克［例（%）］伴并发症［例（%）］PCIS评分（分）PELOD-2评分（分）心率（次/min）呼吸频率（次/min）平均动脉压（mmHg）氧合指数（mm Hg）PLT（×109/L）血红蛋白（g/L）FIB（g/L）ALT（U/L）AST（U/L）WBC（×109/L）机械通气时间（d）重症监护室停留时间（d）PI3K mRNA 相对表达量MMP-9（μg/L）肺泡灌洗治疗药物［例（%）］万古霉素美罗培南预后不良组（n=29）预后良好组（n=74）t/χ2值1.820 P值0.177 11（37.93）18（62.07）4.21±0.52 103.19±3.82 14.27±1.69 39（52.70）35（47.30）4.34±0.56 104.21±3.92 14.53±1.75 1.080 1.196 0.685 1.413 0.283 0.234 0.495 0.493 7（24.14）9（31.03）13（44.83）38.76±0.61 5（17.24）15（51.72）83.01±10.89 4.02±0.63 111.92±14.39 31.25±3.47 61.31±9.54 278.57±26.09 198.49±20.15 132.68±13.03 3.25±0.46 34.01±4.05 36.13±4.16 18.17±2.61 5.12±0.81 12.08±2.19 7.23±1.15 43.14±6.03 23（31.08）27（36.49）24（32.43）38.59±0.58 3（4.05）22（29.73）91.27±12.55 2.78±0.41 108.37±13.91 32.84±4.02 64.48±10.13 297.95±32.54 206.56±31.41 136.17±12.59 3.43±0.51 32.32±4.13 34.49±3.82 17.12±2.48 4.58±0.69 11.25±2.02 6.08±1.04 33.27±5.18 1.319 5.058 4.379 3.113 11.763 1.154 1.873 1.451 2.864 1.282 1.253 1.654 1.878 1.911 1.904 3.399 1.832 4.898 8.298 0.345 0.190 0.025 0.036 0.002 0.000 0.251 0.064 0.150 0.005 0.203 0.213 0.101 0.063 0.059 0.060 0.001 0.070 0.000 0.000 0.557 14（48.28）15（51.72）31（41.89）43（58.11）

2.3 影响PICU 重症肺炎患儿预后的logistic 多因素分析以PICU 重症肺炎患儿预后为因变量（预后良好=0，预后不良=1），合并休克占比、伴并发症占比、PELOD-2 评分、机械通气时间、PI3K mRNA 相对表达量、MMP-9 水平、PCIS 评分、氧合指数为自变量（赋值为原始数值），进行logistic 回归分析（引入水准为0.05，排除水准0.10），多因素分析结果显示：合并休克（OR=4.104，95%CI：1.689～9.974）、PELOD-2 评分（OR=4.764，95%CI：1.960～11.577）、PCIS 评分（OR=5.068，95%CI：2.085～12.318）、PI3K（OR=3.924，95%CI：1.614～9.536）、MMP-9（OR=3.873，95%CI：1.594～9.412）是影响PICU 重症肺炎患儿预后的因素（P< 0.05）。见表2。

表2 影响PICU 重症肺炎患儿预后的多因素分析Tab.2 Analysis of multiple factors affecting prognosis of PICU children with severe pneumonia

2.4 肺泡灌洗液中PI3K、MMP⁃9表达水平与患儿PELOD⁃2 评分、PCIS 评分的相关性分析Pearson相关性分析显示：PICU 重症肺炎患儿肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表达水平与患儿PCIS 评分均呈负相关（r=-0.598，P=0.000；r=-0.537，P=0.000），肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表达水平与患儿PELOD-2 评分均呈正相关（r=0.546，P=0.000；r=0.571，P=0.000）。

2.5 肺泡灌洗液中PI3K、MMP⁃9 预测PICU 重症肺炎患儿预后的价值ROC 曲线结果显示，PI3K、MMP-9及二者联合预测PICU 重症肺炎患儿预后的灵敏度分别为75.86%（95%CI：56.08%～88.98%）、72.41%（95%CI：52.51%～86.55%）、82.76%（95%CI：63.51%～93.47%），特异度分别为75.68%（95%CI：64.07%～84.58%）、79.73%（95%CI：68.47%～87.85%）、89.19%（95%CI：79.28%～94.88%），AUC 分别为0.762（95%CI：0.666～0.859）、0.767（95%CI：0.670～0.873）、0.909（95%CI：0.848～0.971）。见表3与图1。

图1 肺泡灌洗液中PI3K、MMP9 预测PICU 重症肺炎患儿预后的ROC 曲线Fig.1 ROC curve of PI3K and MMP9 in alveolar lavage fluid to predict prognosis of PICU children with severe pneumonia

表3 PI3K、MMP-9 预测PICU 重症肺炎患儿预后的价值分析Tab.3 Value analysis of PI3K and MMP-9 in predicting prognosis of PICU children with severe pneumonia

3 讨论

PICU 重症肺炎若不及时治疗可诱发多脏器功能衰竭，增大预后不良风险［12-14］。纤维支气管镜下敏感抗生素肺泡灌洗可清除炎性分泌物，阻止致病菌毒素吸收，改善肺炎患儿肺部气道功能［15-16］。但临床工作中发现PICU 重症肺炎患儿预后仍不甚理想，影像学检查是评估PICU 重症肺炎患儿病情的常用手段之一，但具有一定滞后性，此外患儿病情进展迅速，易错过最佳治疗时机［17］。临床迫切需求更多安全、高效、客观的生化标志物辅助早期预测、指导PICU 重症肺炎患儿的治疗。本研究从PICU 重症肺炎患儿肺泡灌洗液中收集炎性反应相关的客观因子PI3K、MMP-9，分析并验证其与患儿预后的关系，以便为肺炎患儿的防治提供参考。

本研究logistic 多因素回归分析结果提示并印证PICU 重症肺炎患儿肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9表达与其预后关系密切。Pearson 相关性分析显提示PICU 重症肺炎患儿肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9表达与其病情有关。肺部炎症的特征是肺部炎性细胞消耗增加和促炎介质分泌，导致肺泡间隙蛋白质渗漏，肺顺应性降低和肺功能损害。PICU 重症肺炎患儿因肺部感染多伴有自噬反应，可诱导、加剧肺部炎性反应，PI3K 信号通路参与调节气道中性粒细胞募集和支气管上皮功能改变，PICU 重症肺炎患儿可能通过激活PI3K/蛋白激酶B 信号通路来抑制支气管上皮细胞自噬，进而抑制肺部感染，有助于临床控制病情，获取良好预后。PU等［18］研究指出，降低PI3K 表达在小儿肺炎中的泛素化，可抑制活性氧诱导的线粒体损伤及炎性反应。王艳琼等［19］研究指出，抑制PI3K/蛋白激酶B信号/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路可促进人肺泡上皮细胞自噬，激活PI3K/蛋白激酶B 信号/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路可抑制人肺泡上皮细胞自噬，进而缓解肺炎链球菌导致的人肺泡上皮细胞损伤。

正常情况下肺组织中仅表达少量MMP-9，但在致病菌刺激下，支气管上皮肺泡细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等肺实质细胞均可产生MMP-9，MMP-9 可降解肺泡壁内几乎所有的胶原纤维、弹性纤维、蛋白聚糖等细胞外基质成分，增加肺泡毛细血管通透性，改变形态，增加微血管通透性，促进肺部炎性反应。此外MMP-9 可诱导中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等炎性细胞向PICU 重症肺炎患儿肺部炎症病灶聚集，同时也可增强炎性细胞的杀伤能力，诱导炎性细胞过量释放炎症蛋白及介质，参与、促进炎症反应，诱导器官损伤及炎症扩散，可造成全身炎症反应综合征，并出现炎症级联反应，严重影响PICU 重症肺炎患儿病情及预后［20］。病理研究［8］指出，MMP-9 表达水平与显微镜下局部肺部炎症和肺泡破坏的程度呈正相关。潘小翠等［21］研究指出，支气管肺炎患儿血清MMP-9 表达水平与炎症反应、肺功能关系密切。吴琳琳等［22］研究显示支气管肺泡灌洗液中MMP-9 表达升高会加重气道炎症程度。ROC 曲线结果显示，PI3K 联合MMP-9 预测PICU 重症肺炎患儿预后的灵敏度、特异度、AUC 最高，说明PICU 重症肺炎患儿肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 联合预测患儿预后效能良好。

综上所述，纤维支气管镜肺泡灌洗液中PI3K、MMP-9 表达与PICU 重症肺炎患儿预后有关，二者联合预测患儿预后效能良好，将其作为预测PICU重症肺炎患儿预后的敏感指标具有一定临床价值。但是影响PICU 重症肺炎患儿病情、预后的因素较多，且本研究样本量有限，在预测患儿预后时不可避免出现偏差，后期仍需针对不足进一步佐证本研究结论。