果糖二磷酸醛缩酶C在结肠癌组织和细胞中的表达及其对生物学行为的影响

程多 褚菲菲 张楠 王晶晶 陈梦阁 岳文莉 郜辉 梁芳

郑州大学附属郑州中心医院 1肿瘤康复科病区，2消化内科 （郑州 450000）

结肠癌（colon cancer，CC）是人类常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年升高，全世界每年新增120 万例结肠癌患者，死亡60 万例［1］。结肠癌发病机制复杂，致癌途径的激活以及防御机制的抑制是导致肿瘤的重要原因，其不但影响消化系统功能，且远处转移可累及肝脏、肺部等器官［2］。当结肠癌被早期诊断时，可以手术治愈，被诊断为晚期时，化疗药物的疗效便十分有限［3］。因此，发现新的治疗手段和治疗靶点至关重要。果糖二磷酸醛缩酶C（fructose‑bisphosphate aldol‑ase C，ALDOC）作为一种糖酵解酶，也是ATP 合成过程中必须需要的酶，其主要存在红细胞和骨骼肌当中［4‑5］，既往研究显示ALDOC 不仅能够参与糖酵解过程，还在细胞形态位置以及自身免疫疾病当中扮演重要角色［6］，随着研究的不断深入，多数学者证实糖代谢异常在肿瘤的发生发展过程起着至关重要作用，目前已成为肿瘤热点研究方向［7‑8］。因此本研究拟讨ALDOC 在结肠癌组织和细胞中的表达和对结肠癌细胞SW620 侵袭转移的影响，以期为结肠癌的临床靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择2021 年1 月到2022 年8 月在郑州大学附属郑州中心医院诊治的90 例结肠癌患者，收集患者的病历资料（包括年龄、性别、肿瘤直径等）及手术切除的结肠癌组织标本及癌旁标本。采集的标本保存于液氮。纳入标准：（1）入选患者均经病理切片确诊为结肠癌；（2）原发性结肠癌，并未经放化疗干预；（3）病理资料均完整；（4）癌旁组织均为远离病灶位置2 cm 以上的组织，且经病理证实正常的组织。排除标准：伴随有其他恶性肿瘤的患者。

1.2 研究材料人正常结肠上皮细胞株FHC、结肠癌细胞株SW620、SW480、HT‑29、HCT‑116（北纳生物科技有限公司）；RPMI 1640 培养液、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；胎牛血清（中国四季青生物公司）；NC inhibitor、ALDOC inhibitor（上海生物工程有限公司）；LipofectamineTM2000 转染试剂盒（美国Invitrogen 公司）；ALDOC、U6、GAPDH 引物（上海华大基因科技有限公司）；BCA 试剂盒、ECL 显影剂（中国碧云天公司）；ALDOC 抗体（美国Abcam公司）；基质金属蛋白酶2/9（matrix metalloprotein‑ase‑2/9，MMP‑2/9）抗体（美国CST 公司）；二抗（北京博尔西科技有限公司）；Thermo 酶标仪（上海热电仪器有限公司）；冷冻离心机（美国Beckman 公司）；Bio‑Rad 蛋白电泳仪、转膜仪、凝胶成像仪（美国伯乐公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与分组细胞培养：FHC、SW620、SW480、HT‑29、HCT‑116 细胞株，培养基为RPOM1640 培养基，含有10%的胎牛血清，然后置于恒温培养箱当中培养，培养条件为：37℃、5% CO2，每间隔2 d 更换一次培养基，然后观察细胞融合度，当达到80%时，加入胰蛋白酶，将细胞消化分散，然后进行传代。

细胞分组：将SW620 细胞分为对照组（未经转染的细胞）、NC inhibitor 组（转染NC inhibitor 的细胞）、ALDOC inhibitor 组（转染ALDOC inhibitor 的细胞）。根据LipofectamineTM2000 说明书，将ALDOC模拟物及阴性对照转染各组SW620、HCT‑116 细胞。转染4 h 后更换培养基，24 h 后通过qRT‑PCR及Western blot 检测是否转染成功。

1.3.2 在线生物数据库分析使用GEPIA 数据库分析ALDOC 在正常结肠组织和结肠癌组织中的表达水平及对患者预后生存期的影响。

1.3.3 RT⁃qPCR检测结肠癌组织及细胞中ALDOC mRNA 的表达采用Trizol 试剂从细胞中提取总RNA，使用反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，并使用SYBR Green 法进行扩增，U6 作内参。反应条件：95℃预变性5 min，95℃ 60 s，60℃ 30 s，共40个循环。使用2‑ΔΔCT公式计算ALDOC 的相对表达水平。PCR 引物序列：ALDOC‑F：5′‑AAACCGA‑AGTCATAGCCACA‑3′，ALDOC‑R：5′‑TCTCCTAA‑GCGATGCTCAAA‑3′；GAPDH‑F：5′‑GAAGGTGA‑AGGTCGGAGT‑3′，GAPDH‑R：5′‑GAAGATGGTG‑ATGGGATTTC。

1.3.4 MTT法和细胞单克隆形成检测细胞增殖细胞转染后，置于培养箱当中继续培养，培养条件：37℃，5% CO2，转染24 h 之后，加入胰蛋白酶来对细胞进行消化，调整细胞数量为1 × 103，接着接种至96 孔板，置于恒温培养箱当中培养，在24、48、72、96 h 时，每个时间点取三个孔均加入MTT溶液，继续培养4 h，离心丢弃培养液上清，采用离心DMSO 将细胞重悬，检测吸光度值（450 nm）。

细胞转染后，继续培养24 h，加入消化酶调整各组细胞浓度为1 × 103/孔，接种到6 孔板当中，置于恒温培养箱当中继续培养10 d，取出各组细胞，加入4%的多聚甲醛溶液，将细胞充分固定，加入结晶紫进一步的染色，采用磷酸缓冲液将多余的结晶紫清除，置于显微镜下观察计数，同时进行拍照。

1.3.5 划痕实验检测细胞迁移能力将各组细胞接种于6 孔板，细胞培养48 h，加入胰蛋白酶消化细胞，然后计数，同时采用培养基将细胞的密度调整为1 × 103，接种到6 孔板中继续进行培养，每组设3 个复孔，观察所有的细胞呈现单臂生长时，采用200 μL 移液器的枪头进行划线，然后采用磷酸缓冲液将游离的细胞洗去，将无血清培养液加入进去继续培养，同时显微镜拍照记录划痕宽度，培养24 h 再次拍照记录划痕宽度。细胞迁移率=（0 h 划痕宽度‑24 h 划痕宽度）/0 h 划痕宽度×100%。

1.3.6 Transwell 小室实验检测细胞侵袭能力取50 μL 的matrigel 基质胶，将其平铺在Transwell 小室平板中，调整细胞浓度为1 × 103，加入到Tran‑swell 上室，同时加入无血清的培养基进行培养，在Transwell 下室当中加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，然后将整个Transwell 小室放置到培养箱当中培养24 h，培养条件为37℃、5% CO2，取出细胞采用磷酸缓冲液将游离细胞去除，加入甲醛进行固定，加入1%结晶紫染色，显微镜下拍照，同时计数。

1.3.7 Western blot 检测细胞ALDOC、MMP⁃2、MMP⁃9 的表达各组细胞加入细胞裂解液，离心所得的上清即为蛋白样品，用BCA 蛋白检测并调整蛋白浓度进行上样，蛋白定量变性后SDS‑PAGE电泳分离，然后进行转膜，转到PVDF 膜上，加入TBST溶液（含有5%的脱脂奶粉）进行封闭120 min，之后加入经过稀释的一抗ALDOC、MMP‑2、MMP‑9（浓度为1∶2 000），置于4℃冰箱当中过夜，次日采用TBST 洗涤3 次后，加入二抗（浓度为1∶10 000），室温下继续孵育120 min，之后加入ECL 显色液，避光孕育30 min，以GAPDH 作为内参，凝胶成像仪下拍照，进行定量分析。

1.4 统计学方法数据分析采用统计学软件SPSS 26.0，画图采用Graphpad5.01，其中计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立t检验，计数资料以例（%）表示，采用χ2检验，P< 0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDOC 在结肠癌组织中的表达GEPIA 数据库分析显示结肠癌组织的ALDOC 表达水平明显高于正常组织（图1A），差异有统计学意义（P< 0.05），说明ALDOC 的表达在结肠癌中具有研究意义。同时本研究分析90 例结肠癌患者组织中ALDOC mRNA（图1B）和蛋白（图1C）水平发现，与癌旁组织相比，结肠癌组织中ALDOC mRNA和蛋白水平明显升高（P< 0.05）。将90 例患者按照ALDOC mRNA 相对表达量（中位数）分为高表达组（58 例）（ALDOC mRNA > 中位数）、低表达组（32例）（ALDOC mRNA ≤ 中位数）。结果（表1）显示，ALDOC 的表达水平与年龄、性别、肿瘤直径等无明显相关性（P> 0.05），而与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有明显的相关性（P< 0.05）。说明ALDOC 在结肠癌组织中表达上调，且扮演致癌基因的角色。

图1 ALDOC 在结肠癌组织中的表达Fig.1 The expression of aldoc in colon cancer

表1 ALDOC mRNA 表达水平与结肠癌患者临床病理因素的关系Tab.1 Relationship between ALDOC mRNA expression level and clinicopathological factors in patients with colon cancern 例（%）

2.2 ALDOC 在结肠癌细胞中的表达与正常结肠上皮细胞FHC 相比，结肠癌细胞系SW620、SW480、HT‑29、HCT‑116 中ALDOC mRNA 表达量明显升高，差异有统计学意义（P< 0.05），见图2A。将ALDOC inhibitor 及其阴性对照转染SW620 细胞后，RT‑qPCR、Western blot 检测SW620细胞中ALDOC mRNA 和蛋白表达水平发现，与NC inhibitor 组相比，ALDOC inhibitor 组ALDOC mRNA和蛋白水平下调（P< 0.05），见图2B‑C，提示成功构建了稳定下调ALDOC 表达的结肠癌细胞系。

图2 ALDOC 在结肠癌细胞中的表达Fig.2 the expression of aldoc in colon cancer cells

2.3 下调ALDOC 抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力与NC inhibitor 组相比，ALDOC inhibitor组单克隆形成数目减少（图3B），24、48、72、96 hOD值降低（图3A），划痕变宽，愈合率降低（图3C），细胞侵袭数减少（图3D），MMP‑2、MMP‑9 表达下调（图3E）。说明下调ALDOC 抑制结肠癌细胞SW620 的增殖、迁移和侵袭。

图3 下调ALDOC 抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力Fig.3 Down‑regulates the ability of ALDOC to inhibit the proliferation，migration and invasion of colon cancer cells

2.4 ALDOC 影响结肠癌细胞恶性表型的作用机制通过检测结肠癌组织和癌细胞中ALDOC 水平，发现ALDOC mRNA 和蛋白水平在结肠癌组织和细胞中表达上调，且ALDOC mRNA 水平与患者肿瘤分化程度、TNM 分期、淋巴结转移有明显的相关性，ALDOC 扮演致癌基因的角色。说明ALDOC与结肠癌进展相关。为了进一步观察ALDOC 对结肠癌细胞恶性行为的影响，检测癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。发现下调ALDOC 抑制细胞增殖；通过下调金属基质蛋白酶MMP‑2、MMP‑9 水平抑制细胞的侵袭转移。由此推断ALDOC1 通过调节MMP‑2、MMP‑9 调控结肠癌细胞的侵袭和迁移能力。见图4。

图4 ALDOC1 影响结肠癌细胞恶性表型的作用机制Fig.4 the mechanism of ALDOC1 affecting the malignant phenotype of colon cancer cells

3 讨论

结肠癌作为我国常见的消化道肿瘤，其发病率以每年4%递增。虽然结肠癌的临床治疗手段有了突破性的进展，但是结肠癌的治疗已进入瓶颈期，开展个体化的分子靶向治疗已经刻不容缓［9］。因此对结肠癌的早期诊断和治疗至关重要。在有氧条件下，正常细胞中线粒体进行有氧代谢，而肿瘤细胞氧气充足情况下，却以糖酵解形式产生能量，而不是以氧化磷酸化形成，学者们将这一现象称之为Warburg 效应［10］。研究已经证实［11］Warburg 效应不仅能够产生能量来满足肿瘤细胞的增殖，还能够为核苷酸、脂质等合成提供物质基础，维持异常增殖、侵袭转移、耐药和免疫逃逸等多种恶性生物学行为。此外，糖酵解过程当中会产生中间体，其在大分子生物合成过程当中扮演着极其重要角色，即使处于营养供应减少的环境中，癌细胞也具有更高的生长优势［12］。因此，降低肿瘤细胞的糖酵解能力对抑制其增殖、转移等恶性生物学行为有重要的意义。近期有研究证实ALDOC 过表达后将会加速糖酵解进程，且其在癌组织和细胞当中高表达，与增殖密切相关，下调ALDOC 将会导致细胞内的ATP 减少，细胞膜破坏，从而抑制肿瘤增殖［13‑16］。本研究发现结肠癌组织及细胞中ALDOC 表达明显高于癌旁组织和正常结肠上皮细胞，且发现ALDOC 表达水平与TNM 分期、淋巴结转移、分化程度存在正相关的关系（P< 0.05）。同时细胞学实验显示，敲低ALDOC水平后，SW620 细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱，说明ALDOC 在结肠癌中发挥促癌作用。

由于结肠与许多相邻结构接触，结肠癌细胞也倾向于积极攻击相邻组织［17］。因此，确定结肠癌侵袭转移的潜在机制至关重要。基质金属蛋白酶是一类能够降解细胞外基质和基底膜的蛋白水解酶，在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润转移中起重要作用，在许多肿瘤组织中，都发现MMP‑2、MMP‑9 高表达［18‑19］。DEGIRMENCI 等［20］报道蛋白激酶B2（protein kinase B2，AKT2）在结肠癌组织中表达升高，AKT2 提高了结肠癌细胞中MMP‑2/9 的表达，从而促进了细胞迁移、侵袭。柳雅雯［21］发现miR‑141‑3p 通过靶向UNC 家族5C（uncoordinated 5C，UNC5C）促进MMP‑2、MMP‑9 表达，从而促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究中下调ALDOC 后，MMP‑2、MMP‑9 表达下降，同时划痕实验和Transwell 小室实验显示细胞的侵袭和迁移能力下降，说明下调ALDOC 通过下调MMP‑2、MMP‑9 水平抑制细胞的侵袭转移。

综上所述，ALDOC 水平在结肠癌组织和细胞中表达上调，且与结肠癌患者的不良预后紧密相关。ALDOC 通过调节MMP‑2、MMP‑9 表达调控结肠癌细胞的侵袭和迁移能力。为MMP‑2、MMP‑9作为结肠癌的诊断标志物和治疗靶点奠定了理论及实验基础。