宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1表达及与术后复发的关系

文丽芳 丁洁

1山西医科大学汾阳学院（山西汾阳 032200）；2山西省汾阳医院（山西汾阳 032200）

宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率在女性肿瘤中均位列前茅，手术和放化疗是目前采取的主要治疗方法。虽然宫颈/阴道脱落细胞学和人乳头瘤病毒检查的普及大大提升早期诊断和治疗率，患者预后得到一定改善［1］，但术后复发仍旧是严重困扰医患的难题，死亡率也并未明显降低，加上近年来年轻化的发病趋势，宫颈癌防治形势依然十分严峻［2］。继续研究发现生物标记物对于降低复发率、有效控制病情发展意义重大。神经轴突导向因子SLITs 是一个分泌蛋白家族，成员包括SLIT1-3，通过Robo 受体结合发出信号，在肿瘤细胞转移等多种生理过程中发挥作用［3］。有研究发现，SPARCL1 是9 个与宫颈癌发生有关的基因之一，在宫颈癌的发展中发挥核心作用，也与癌前病变和肿瘤细胞迁移过程有关［4］。目前关于SLIT3、SPARCL1 与宫颈癌的研究较少，本研究通过对107 例宫颈癌患者癌细胞SLIT3、SPARCL1 蛋白表达进行观察和研究，探讨其表达水平与根治术后复发的相关性。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2019年10月至2021年4月在医院接受宫颈癌根治术治疗的107 例患者作为研究对象，另选取子宫肌瘤等子宫良性病变行手术切除的30 例患者正常宫颈组织作为对照组。纳入标准：（1）首次接受根治术治疗，经病理组织学确诊为宫颈癌；（2）年龄超过18岁；（3）临床资料完整；（4）术前未采用化疗、放疗等其他抗肿瘤治疗，术后采用相同的抗肿瘤方案；（5）FIGO 2018 分期Ⅰ-Ⅱa 期。排除标准：（1）合并心、肝、肾、肺等其他重要脏器功能不全；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）合并免疫系统疾病；（4）术后未经病理组织学确诊。107例患者年龄25～78岁，平均（52.65±11.57）岁；临床分期：Ⅰa 期23 例，Ⅰb 期39 例，Ⅱa 期45 例；病理分级：低分化27 例，中分化43 例，高分化37 例；病理类型：鳞癌78 例，腺癌29 例；淋巴结转移25 例，未转移82 例；肿瘤最大径未超过4 cm 共72 例，超过4 cm 共35 例；基质浸润深度：> 50%共84 例，≤ 50%共23 例。本次研究获得医院伦理委员会会议表决通过后实施。

1.2 治疗方法和标本采集所有患者均符合手术指征，根据患者肿瘤大小、临床分期、病理分级等采取标准及个体化的手术及术后辅助治疗［5］。术中采集患者宫颈癌组织液氮保存备用。

1.3 实验方法（1）提取组织总RNA：标本组织剪碎加入Trizol 试剂（福州飞净生物科技有限公司，货号：PH1420）600 μL 和400 μL 充分研磨组织；1.5 mL EP 管收集研磨液，5427R 超低温离心机（德国艾本德公司）4 ℃、12 000 r/min 离心15 min；离心后取上清液转移至新EP 管中，按1：1 体积加入异丙醇，充分混匀后静置10 min 再次离心分离；去上清后加入75%酒精1 mL，充分混匀后离心；再次去上清，冰上晾干残留酒精，加入适量DEPC水，吹打混匀后溶解提取RNA；使用UV5Nano 超微量分光光度计（梅特勒-托利多国际有限公司）测定样本RNA 浓度，A260/280 在1.8～2.0 区间内为合格，-20 ℃冰箱保存待用。（2）根据试剂盒说明书准备逆转录反应体系，将FastKing RT Enzyme Mix 加到cDNA 去除步骤反应中，充分混匀后42 ℃孵育15 min；95 ℃孵育3 min 后合成的cDNA 反应液-20 ℃保存待下游荧光定量检测。（3）实时荧光定量检测（PCR）：采用FastKing 一步法RT-PCR试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，目录号：KR123］，配制扩增反应体系；待测溶液离心后于7500 Fast 实时荧光定量PCR 系统（美国赛默飞公司）中检测，参数设置：95 ℃预变性15 min，95 ℃10 s 退火，60 ℃ 32 s 延伸，40 cycles。反应结束后收集数据，计算相对表达水平。SLIT3 引物序列：上游：ATCAACTGCCTGCGGGTAAA；下游：CAAGTGGCAGTCGCAAACAA；SPARCL1 引物序列：上游：TTGGCTCCTGGTGTTAGTTC，下游：ATCCTGCTCTTGG-TTTCCTT。（4）免疫组化检测：标本组织固定于载玻片上，经烘烤、二甲苯浸泡、风干后置于浓度递减的乙醇中静置，每个浓度5 min；高温抗原修复后将切片洗涤3 次；分别加入一抗兔抗人重组抗体（SLIT3 和SPARCL1，美国Abcam 公司，货号：ab198726、ab255597），4 ℃冰箱孵育过夜；次日组织表面滴加即用型山羊抗兔二抗；加入预先调制好的DAB 显色液进行显色。苏木素染色，按组织按照浓度由低到高排列，分别在不同浓度乙醇、二甲苯、甲苯中静置5 min，树胶封片。根据着色程度和面积进行评分，着色按照强、中、弱、无分别计3 分、2 分、1 分和0 分；视野面积超过75%计4 分，超过50%计3 分，超过25%计2 分，未超过25%计1 分。将二种评分方法得出的分数相乘作为最终分数（0～12 分）。5～12 分为高表达，1～4 分为低表达，0 分为不表达。高表达为高表达组，低表达或不表达为低表达组。

1.4 随访以术后第1天作为随访起点，术后12个月期满或患者复发作为随访终点；每3 个月通过电话、门诊、住院等多种方式结合的方法进行1 次随访；所有患者未失访。

1.5 统计学方法采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析。计量资料经检验符合正态分布采用“±s”表示，独立样本间差异采用t检验，多组间比较采用方差分析；不符合正态分布采用非参数检验。采用COX 回归模型分析术后复发因素。P< 0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访结果所有患者均随访1 年，其中25 例患者复发，82 例患者未复发。

2.2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在宫颈癌、正常宫颈组织中表达宫颈癌组SLIT3、SPARCL1 mRNA表达显著低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在宫颈癌、正常宫颈组织中表达Tab.1 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer and normal cervical tissues ±s

组别宫颈癌组对照组t值P值例数107 30 SLIT3 mRMA 0.24±0.18 1.27±0.05 30.934 0.000 SPARCL1 mRNA 0.15±0.18 1.35±0.21 31.087 0.000

图1 免疫组化检测SLIT3、SPARCL1 在宫颈癌及正常宫颈组织中的表达Fig.1 Immunohistochemical detection of the expression of SLIT3 and SPARCL1 in cervical cancer and normal cervical tissue

2.3 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在复发、未复发患者宫颈癌组织中表达复发组患者宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 mRNA 水平显著低于未复发患者，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表2。

表2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在复发、未复发患者宫颈癌组织中表达Tab.2 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of recurrent and non-recurrent patients ±s

表2 SLIT3、SPARCL1 mRNA 在复发、未复发患者宫颈癌组织中表达Tab.2 Expression of SLIT3 and SPARCL1 mRNA in cervical cancer tissues of recurrent and non-recurrent patients ±s

组别复发组未复发组t值P值例数25 82 SLIT3 mRMA 0.12±0.11 0.28±0.15 5.946 0.000 SPARCL1 mRNA 0.09±0.08 0.17±0.15 2.552 0.012

2.4 宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与术后复发107 例根治术患者中25 例患者术后复发，复发率为23.36%；根据SLIT3、SPARCL1 免疫组化检测结果分为SLIT3 低表达组（61 例）、SLIT3高表达组（46 例）、SPARCL1 低表达组（65 例）、SPARCL1 高表达组（42 例）。SLIT3 低表达患者术后复发率（31.15%）显著高于SLIT3 高表达患者术后复发率（13.04%），SPARCL1 低表达患者术后复发率（32.31%）显著高于SPARCL1 高表达患者术后复发率（9.52%），差异有统计学意义（P< 0.05）。见表3。

表3 宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与术后复发Tab.3 Expression of SLIT3 and SPARCL1 proteins in cervical cancer tissue and postoperative recurrence

2.5 宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与临床病理特征相关性宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1蛋白表达与分化程度、临床分期、淋巴结转移、基质浸润深度相关，与年龄、病理类型、肿瘤最大径无关。见表4。

表4 宫颈癌组织 SLIT3、SPARCL1 表达与临床病理特征相关性Tab.4 Correlation between the expression of SLIT3，SPARCL1 and clinicopathological characteristics in cervical cancer 例

2.6 影响宫颈癌患者根治术后复发的危险因素将SLIT3 蛋白高表达、SPARCL1 蛋白高表达、间质浸润深度≤ 50%、无淋巴结转移、低分化程度、Ⅰa/Ⅰb 分期赋值为0，SLIT3 低表达、SPARCL1 低表达、基质浸润深度> 50%、淋巴结转移、中/高分化程度、Ⅱa 分期赋值为1。COX 单因素分析显示，分化程度、临床分期、淋巴结转移、基质浸润深度、SLIT3 表达、SPARCL1 表达与宫颈癌患者根治术后复发相关（P< 0.05），见表5；COX 多因素分析显示，中/高分化、Ⅱa 分期、淋巴结转移、基质浸润深度 > 50%、SLIT3 低表达、SPARCL1 低表达是影响宫颈癌患者根治术后复发的独立危险因素（P<0.05），见表6。

表5 COX 单因素分析Tab.5 COX single factor analysis

表6 COX 多因素分析Tab.6 COX Multi-factor Analysis

3 讨论

作为早期宫颈癌的主要治疗方法，宫颈癌根治术有效提高了患者总生存率［6-7］，但是术后复发率尤其是局部复发居高不下，术后复发和转移仍旧是临床面临的重要难题。术后辅助放疗、化疗及同步放化疗是宫颈癌患者生存获益的主要方式。通过更多的特异性指标预测患者术后复发对于患者预后意义重大。

神经导向因子是一种在神经系统发育过程中调控神经元的发生与迁移、对神经元轴突传达吸引或排斥信号的生物分子，包括SLITS、Ephrins、Semaphorins 等诸多分子家族［8-10］。许多神经导向因子和炎症、肿瘤发展等病理过程密切相关。相关研究发现，SLIT/Robo 信号通路可调控肿瘤细胞的增殖、侵袭、侵袭、粘附等，在肿瘤的发生、发展和转移中发挥巨大作用［11］。有研究指出，SLIT3 在多种肿瘤组织中的表达显著低于正常组织，且SLIT3低或过表达会影响肿瘤增殖、侵袭等行为［12］。NARAYAN 等［13］研究显示，SLIT3/Robo 信号通路相关蛋白在宫颈癌组织中低表达或不表达，可能是由于DNA 甲基化调控导致的。

SPARCL1 是细胞基质蛋白（SPARC）中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白家族成员。SPARCL1 蛋白是具有抗粘附、抗增殖和抗致癌效果的细胞基质蛋白，调控细胞间粘附、迁移和侵袭，可通过调节肿瘤生长和分化参与肿瘤的发生与发展［14］。近年来相关研究显示，SPARCL1 在多种恶性肿瘤组织中的表达下调甚至缺失，这也加快了肿瘤的侵袭和转移［15］。相关研究发现SPARCL1 与宫颈癌发病过程中的癌前病变和迁移过程有关，可能是一种新的癌症预测标志物，也是宫颈癌发生和发展的潜在治疗靶点［16］。

本研究中，宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 mRNA表达明显低于正常宫颈组织，且与术后未复发患者比较，术后复发患者宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 mRNA 表达明显偏低，同时宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与分化程度、临床分期、淋巴结转移、基质浸润深度相关，提示宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1在宫颈癌病情发展和预后中有重要参与。对SLIT3、SPARCL1 蛋白表达分组患者研究显示，低表达患者术后复发率明显高于高表达患者，提示SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与患者术后复发密切相关。通过COX 单因素和多因素分析显示，中/高分化、Ⅱa 分期、淋巴结转移、基质浸润深度> 50%、SLIT3 低表达、SPARCL1 低表达是影响宫颈癌患者根治术后复发的独立危险因素，可作为宫颈癌根治术预后预测的有效指标。

综上所述，宫颈癌组织SLIT3、SPARCL1 蛋白表达与宫颈癌患者临床病理特征和术后复发关系密切，具有成为宫颈癌病情和预后评估的生物标志物的潜力。