沉默信息调节因子1基因多态性与广西人群显微镜下多血管炎的病例对照研究

冯菲 蓝晶晶 薛超

1广西医科大学第二临床医学院（南宁 530021）；2广西医科大学第二附属医院肾内科（南宁 530007）

抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）是一种罕见的异质性疾病，主要表现为中小血管的炎症和坏死。AAV 通常包括以下临床亚型：肉芽肿伴多血管炎（GPA）、显微镜下多血管炎（MPA）和嗜酸性肉芽肿伴多血管炎（EGPA）［1］。既往研究表明，地理和民族差异导致AAV 在不同地区的临床表型存在差异。肉芽肿伴多血管炎（GPA）是北欧人群AAV 的主要类型，而显微镜下多血管炎（MPA）是亚洲人群AAV 的主要类型［2］。据报道，MPA 的发病率为0.5～24.0 例/百万人年，患病率为9.0～94.0 例/百万人年，发病年龄为55～75 岁［3］。

AAV 的发病机制未阐明，流行病学的显著差异［4］提示了AAV 具有遗传易感性背景。研究发现，AAV 与CTLA-4、FCGR2A、PTPN22、SERPINA1、TLR1 和TLR9 等遗传变异之间存在显著相关性，这些变异均来自非MHC 区域。不同临床亚型其遗传背景不同。例如，GPA 与HLA-DP1 有关，MPA与HLA-DQ 有关，EGPA 与HLA-DRB4 有关。上述成果不仅有助于解释AAV 的病因，还可为诊断和靶向治疗提供生物标志物［5］。Sirtuins 家族，其独一无二的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的去乙酰化酶功能引起了人们的广泛关注。沉默信息调节因子1（SIRT1），sirtuins 家族成员之一，承担了p53、叉头盒O（FoxO）等多种转录因子和协同调节因子的去乙酰化。SIRT1 可通过调节细胞分泌参与糖代谢、神经内分泌功能、炎症和肿瘤发生等生理过程［6］。此外，SIRT1 可影响多种自身免疫性疾病的发病，如：类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、炎性肠病（IBD）、多发性硬化症（MS）等，是自身免疫性疾病的潜在治疗靶点［7］。然而，目前未见SIRT1 基因变异与MPA的关联性研究。为此，本研究选择rs1467568 和rs4746720 为候选SNP，探索SIRT1 突变是否影响广西人群MPA 的发生。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究的病例组源于2005-2020年在广西医科大学第二附属医院肾内科、风湿病科确诊为MPA的患者，共208例。纳入的MPA患者中，包括78 例男性（37.5%）和130 例女性（62.5%），平均年龄为（54.6±14.9）岁。其严格参照2012 年Chapel Hill 国际血管炎命名会议标准进行诊断［8］，排除了由感染、药物治疗、系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿性关节炎（RA）和类风湿性紫癜（HSP）等引起的继发性血管炎。同时，选取了211 例与MPA组年龄、性别较为匹配的健康志愿者作为对照组。其中包含了83 例男性（39.3%）和128 例女性（60.7%），平均年龄为（51.2±12.6）岁。一切遵循世界医学协会《赫尔辛基宣言》原则，已获得广西医科大学第二附属医院医学伦理委员会批准（编号：2018 KY-0100）。所有受试者均签署了书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 资料收集收集MPA 患者的一般资料、临床资料与实验室生化指标。一般资料包括受试者的年龄、性别、血压等。临床资料的收集以MPA患者发病所伴随的咳嗽、发热、水肿等一系列临床症状为主。实验室生化指标，即红细胞、白细胞、血小板计数以及其他检测指标。

1.2.2 基因组DNA 的提取采集所有受试者的外周静脉血5 mL 置于EDTA 抗凝采血管，根据DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］操作说明提取外周血DNA。所纳入的DNA 样本：DNA纯度（A260/A280）：1.8～2.0，DNA浓度> 50 μg/mL，将标本放置-20 ℃冰箱以供后续实验。

1.2.3 目的SNP 的选取利用Ensembl 浏览器（https：//ensemblgenomes.org）对中国南方汉族人群（CHS）和中国北京汉族人群（CHB）进行基因座选择。其筛选标准如下：（1）最小等位基因频率（MAF）≥ 0.05；（2）遵循哈迪-温伯格平衡（Hardy‑Weinberg Equilibrium，HWE），P> 0.05；（3）已有文献证明目标位点与自身免疫性疾病相关。

1.2.4 基因分型通过多重聚合酶链反应（PCR）结合高通量测序法［生工生物工程（上海）股份有限公司］对目标位点进行检测。首先，需设计并合成引物池，然后通过两步PCR 法扩增SNP 位点序列制备一个Illumina 测序文库。首轮扩增体系如下：DNA 模板（10 ng/μL）2 μL；上游引物池（10 μmol/L）1 μL；下游引物池（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL （总体积25 μL）（Kapa HiFi Ready Mix）。待反应体系配制好后，通过PCR 仪（BIO-RAD，T100TM）完成如下扩增：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8 个循环；98 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 个循环；72 ℃延伸5 min。待反应完成，温度维持在4 ℃以保存产物；利用1%琼脂糖胶电泳检测扩增产物，产物将被AMPure XP 磁珠纯化回收。

第二轮的扩增须以首轮产物为模板，目的是获得测序带分子标签的文库。反应体系如下：DNA 模板（10 ng/μL）2 μL，通用P7 引物（含分子标签，10 μmol/L）1 μL；通用P5引物（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL （总体积30 μL）。体系准备就绪后，进行如下扩增：98 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共5 个循环；最后72 ℃延伸5 min，反应结束，产物仍在4 ℃中进行保存。PCR 产物仍以AMPure XP 磁珠纯化回收方式进行回收。待所有扩增产物混合后，将通过HiSeq XTen 测序仪（Illumina，San Diego，CA）展开测序。引物序列依次为：F1：5′-CCAATGAAGTTCTTTCTACAGCACA-3′，R1：5′-ATGCAGTATGAAAAAGTTCGAGAGC-3′，F2：5′AAAAGTAAAGA‑CAACCGAGTGCTCT-3′，R2：5′-AGTTTTCAAAAAGCCATCGGAATGT-3′。

1.3 统计学方法对于正态分布/近似正态分布的定量资料，采用（±s）描述其平均水平；而偏态分布的计量资料则用M（P25，P75）表示。利用χ2检验或Fisher 精确概率检验来估计两组间的基因型和等位基因频率分布。通过SHEsis 生信软件进行连锁不平衡（LD）和单体型分析。应用SNPstats 生信网站进行年龄分层分析，计算和评估五种遗传模型下的基因型与MPA 发病风险之间的关系，计算优势比（ORS）和95%置信区间（CIS）。采用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析，以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型、等位基因频率的比较MPA组与对照组均符合Hardy‑Weinberg 平衡（MPA 组：χ2=0.569，P=0.451；对照组：χ2=0.641，P=0.423），即证明所纳入的研究对象具人群代表性。Rs1467568、rs4746720 的基因型、等位基因频率在两组中的分布差异均无统计学意义（P> 0.05），见表1。

表1 SIRT1 rs1467568、rs4746720 基因型和等位基因在MPA 组和对照组中的分布Tab.1 Distribution of SIRT1 rs1467568 and rs4746720 genotype and allele in MPA group and control group 例（%）

2.2 按年龄分层后的遗传模型分析Rs1467568的显性模型（OR=0.50，95%CI：0.27～0.92，P=0.026）、超显性模型（OR=0.49，95%CI：0.26～0.92，P=0.026）和加性模型（OR=0.57，95%CI：0.33～0.99，P=0.045）均能降低老年组（≥ 54 岁）MPA 的发病风险。而rs4746720 的各遗传模型均显示两个不同年龄组的个体与MPA 的发病风险缺乏相关性，差异均无统计学意义（P> 0.05），见表2。

表2 SIRT1 基因多态性在不同年龄段人群中的分布以及与MPA 发病风险的相关性Tab.2 Distribution of SIRT1 gene polymorphisms in different age groups and its association with the risk of MPA

2.3 基因型与临床症状的相关性分析Rs1467568、rs4746720 各基因型与发热、咳嗽、水肿、咯血、血尿以及蛋白尿症状的发生差异均无统计学意义（P> 0.05），见表3。

表3 rs1467568、rs4746720 各基因型的临床症状比较（MPA 组）Tab.3 Comparison of clinical symptoms of rs1467568 and rs4746720 genotypes （MPA group） 例（%）

2.4 基因型与实验室指标的分析在MPA 患者中，与AA、AG（rs1467568）基因型相比，GG 基因型的谷丙转氨酶（ALT）水平显著升高，差异有统计学意义（P=0.012）；而CC（rs4746720）基因型的谷草转氨酶（AST）水平较TT、TC 基因型低，差异有统计学意义（P=0.036）。除此之外，两位点的基因型与其他各实验室指标差异均无统计学意义（P> 0.05），见表4。

表4 rs1467568、rs4746720 各基因型与实验室生化指标的关联性分析（MPA 组）Tab.4 Analysis of the relationship between rs1467568，rs4746720 genotypes and laboratory biochemical indexes（MPA group）M（P25，P75）

2.5 连锁不平衡与单体型分析研究证明，SIRT1 rs1467568 和rs4746720 处于完全连锁不平衡状态（D1=1.000，r2=0.141）；两位点所构建的单体型与MPA 的遗传易感性并不相关（P> 0.05），见表5。

表5 单体型与MPA 遗传易感性的关系Tab.5 Relationship between haplotypes and genetic susceptibility to MPA 例（%）

3 讨论

ANCA 相关性AAV 是一种死亡率高且易复发的自身免疫性疾病。免疫抑制剂的问世使AAV在治疗方面实现了质的飞跃，该血管炎可从产生症状后1～2 年内死亡率极高的异质性疾病转变为需终生治疗的慢性疾病。但非特异性治疗带来的不良免疫和代谢反应，已严重影响患者的生活质量乃至威胁生命健康。故该病的治疗领域中挑战一直存在［3］。

该血管炎的发病机制可受遗传因素、环境因素等影响，其发病过程因复杂而备受争议。既往研究［9］证实了ANCAs 过度激活中性粒细胞可诱导其形成中性粒细胞外陷阱（NETs），且NETs 可通过ANCA的介导导致血管损伤并参与ANCAs的产生。故认为NETs 与ANCA 调控所形成的恶性循环有助于AAV 的发病。体外实验［10］表明ANCA 可诱导自噬，而自噬对ANCA 所诱导的NETs 的形成发挥促进作用。ZHU 等［11］通过功能获得和功能丧失实验证明了SIRT1 介导的FoxO1 易位和去乙酰化在H2S 诱导的内皮细胞自噬过程中扮演重要角色；且H2S 对血管的保护作用由SIRT1-FoxO1 信号通路介导的血管内皮细胞自噬完成。基于以上研究背景，猜测SIRT1 可能参与ANCA 相关性血管炎的发病，SIRT1 启动自噬，调节中性粒细胞外部网（NETs）的紊乱，减轻血管内皮细胞的炎症反应，保护血管。

SIRT1 蛋白是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，高度保守［12］，是sirtuin 家族中研究最深入的一员。SIRT1 对免疫反应的有效调节［13］源于该基因对多种蛋白的乙酰化修饰，其中包括了组蛋白、代谢酶等［14-15］。SIRT1 的表达与多种血管炎发病机制相关已被报道。XIE 等［16］通过实验发现，在活动性眼部白塞病患者中，SIRT1 表达降低；而后续实验直接证实了活动性眼部白塞病的发生得益于SIRT1 表达的降低影响了Th17 和Th22 细胞的反应。意大利的一项横断面研究［17］显示，巨细胞动脉炎（GCA）患者外周血单核细胞（PBMC）中SIRT1 的表达明显低于健康对照组，不由得猜测GCA 患者SIRT1 表达的降低可能受并行的氧化应激影响，其过程可能涉及该血管炎的发病机制，需更深入研究证明此观点。SHIMOJIMA 等［18］试图探究ANCA 相关性管炎（AAV）中调节性T 细胞（Treg）稳定性与活性氧的关系时意外发现，相比于健康对照组，AAV 患者Treg 中SIRT1 表达降低；经白藜芦醇治疗后的AAV 患者Treg 表现为SIRT1表达升高。近年来，SIRT1 的遗传变异已被广泛讨论。HOU 等［19］研究显示，rs1467568 AG 基因型可能是1 型心肾综合征（CRS1）发病的保护因素（P=0.019）。在529例中国汉族类风湿性关节炎患者和700 例健康对照中［20］，学者发现rs1467568 可影响中国汉族人群类风湿性关节炎的遗传易感性（P=0.011）。有趣的是，在糖尿病肾病［21］中，rs4746720 的TC 基因型携带者发生该疾病的风险低于TT、CC 基因型携带者（P< 0.01），但T 等位基因又是糖尿病肾病的风险等位基因（P=0.01）。还有研究［22］表明SIRT1 已成为治疗2 型糖尿病的一个很有前景的治疗靶点。更有学者发现SIRT1 rs12778366 位点可能/间接影响2 型糖尿病的遗传易感性；还可能影响SIRT1 mRNA 的表达并进一步影响利拉鲁肽和二甲双胍对既往血糖控制不佳 2 型糖尿病患者临床疗效［23］。本研究结果表明，在年龄≥ 54 岁亚组中，rs1467568 的显性模型AA+AG 基因型、超显性模型AG 基因型以及加性模型可能与MPA易感性降低相关，可视为疾病发生的保护因素，这与其他研究结果类似。Rs1467568位于内含子区域，其位点可能通过中断翻译和剪接的过程影响SIRT1 基因的转录，改变氨基酸序列。SIRT1 可因其去乙酰化酶活性直接参与自噬过程的调节，还可通过间接改变上游调控因子实现自噬活性的调节［24］。故猜想，SIRT1 的遗传变异（rs1467568）导致SIRT1自身的表达异常，进而启动自噬，影响MPA 易感性。

本次实验室检查结果显示，患者的丙氨酸氨基转移酶（rs1467568）、天门冬氨酸氨基转移酶（rs4746720）水平在不同基因型间差异有统计学意义。早有研究证明SIRT1 在维持代谢过程（包括糖异生和脂质合成）的昼夜节律调节中发挥核心作用，从而影响肝脏再生过程［25-26］。笔者大胆推测，SIRT1 基因的遗传变异影响了自身去乙酰化过程，从而影响了肝脏的代谢，造成丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶在不同基因型之间存在差异。

本研究在探讨SIRT1 基因多态性与MPA 易感性相关性过程中，存在多处空白：样本量小，部分临床资料缺失，影响统计分析；研究人群仅来自一个地区，存在选择偏倚等。因此，将继续扩大样本量，完善临床资料，深入研究SIRT1 遗传变异与MPA 发病机制的关联性。

综上所述，SIRT1 rs4746720与广西人群的MPA风险无关。尽管其他结果显示SIRT1 rs1467568 与MPA 无相关性，但年龄分层分析显示，rs1467568（年龄≥ 54 岁）的显性模型、超显性模型以及加性模型降低了MPA 的发病风险。另外，SIRT1多态性rs1467568 可能与丙氨酸氨基转移酶水平相关、rs4746720 与天门冬氨酸氨基转移酶水平相关。