液相色谱测定饲料中呕吐毒素的不确定度分析

杨丽军，夏 楠，方申超，徐 迪，张冬冬

（1.芜湖职业技术学院，安徽 芜湖 241000；2.芜湖市农产品食品检测中心，安徽 芜湖 241000）

呕吐毒素，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），可由漆班菌属、镰刀霉菌属等真菌产生[1-2]。呕吐毒素具备高的细胞毒性和免疫抑制性，会使猪的造血系统遭受损害并造成死亡[3-4]，故已严格控制使用。在GB/T 30956—2014标准中指出，猪饲料呕吐毒素的含量不能超过1.0 mg/kg[5]。所以，在日常生活中任何可能含有呕吐毒素的物品都应该被准确测定。

不确定度是对结果的合理表征[6]，观察被测量值的分散性与测量结果的可用性，是表示检测值是否准确的重要参数[7-10]，所以实验室进行权威认可前均需进行不确定度评定。李万鹏等人[11]、陈曦等人[12]曾对饲料、参类等食品中赭曲霉毒素和人参皂苷等不同参数的测定进行不确定度评定，发现产生不确定度的主要来源有分析仪器、回收率等。

目前，我国测定呕吐毒素的方法包括高效液相色谱法（HPLC）、胶体金快速试纸条法、衰减全反射-傅立叶红外光谱法（ATR-FTIR）、酶联免疫吸附法（ELISA）等[13-16]。但因高效液相色谱法测定结果准确且仪器操作简单并可重复使用，所以试验利用高效液相色谱法测定饲料中的呕吐毒素。

GB/T 30956—2014中介绍了免疫亲和柱-高效液相色谱法测定饲料中呕吐毒素含量的方法，以此方法为基础并根据Robertson M，Kuang Y C等人[17-18]对不确定度的研究，进行不确定度评定，以此为同行业研究者提供理论支持。

1 试剂与仪器

1.1 试验试剂

呕吐毒素标准物质（质量浓度50μg/mL），青岛普瑞邦生物工程有限公司提供；蒸馏水；聚乙二醇，海安石油化工厂提供；盐酸，伊犁新天煤化工有限责任公司提供；氢氧化钠，天津市福晨化学试剂厂提供；甲醇（色谱纯），绿环化工厂提供。

1.2 试验仪器

电子天平（感量0.01 mg），上海韬易实业有限公司产品；LC/20A型高效液相色谱仪、C18型色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm），岛津公司产品；呕吐毒素免疫亲和柱，北京华安麦科生物技术有限技术产品；离心机，日本HITACHI公司产品；振荡器，TAITEC实验设备公司产品。

2 试验方法

参照GB/T 30956—2014对饲料中呕吐毒素的含量测定方法进行[19-21]。因为蒸馏水的安全性大且无特殊气味，所以试验用水均为蒸馏水。再利用免疫亲和柱对液体进行净化，最后洗脱、检测。

2.1 样品处理

从饲料袋中取出饲料粉碎，用间距1 mm分样筛筛出较细饲料，称取10.0 g饲料放置在50 mL离心管中，加入PEG 2.0 g，蒸馏水50 mL，置于200～300 r/min的振荡器中剧烈振荡20 min，再在离心机中以转速8 000 r/min处理5 min，从而提取饲料中的呕吐毒素。取上清液，用0.01 mol/L HCl或0.01 mol/L NaOH调节上清液pH值为6～8，用以进行下一步净化。

2.2 样品净化

呕吐毒素免疫亲和柱可特异性吸附液体中的呕吐毒素：将呕吐毒素免疫亲和柱插在气控操作架的注射器上，将10.0 mL的医用注射器连接在亲和柱上，调节开关使亲和柱保护液以约1 d/s的流速全部通过免疫亲和柱。吸取2.5 mL上述上清液注入医用注射器中，直至上清液全部通过，用20.0 mL蒸馏水洗涤免疫亲和柱，流速约为1 d/s或2 d/s，直到蒸馏水全部通过。将亲和柱从操作架取下、吹干。

2.3 样品洗脱

液体排干后，将1.0 mL的甲醇注入亲和柱中，精确地把呕吐毒素从亲和柱上洗脱下来，流速约为1 d/s，所有的洗脱液收集在干净的玻璃管中，并在50～60℃加热条件下用氮气吹至干燥，残留物用1mL流动相复溶，并用0.22μm的有机滤膜过滤至样品瓶中，上液相色谱进行分析。

2.4 呕吐毒素标准溶液配制

试验使用质量浓度为50μg/mL呕吐毒素标准溶液，加入流动相稀释为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0μg/mL，用作试验的6个标准工作液。

2.5 液相色谱条件

C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；液相色谱检测器：荧光检测器；流动相：甲醇-水（20∶80）；柱温：25℃；流动相流速：1.0 mL/min；进样量：20μL；定量利用的是曲线的峰面积，定性利用的是保留时间[22]。

2.6 样品测定

饲料测定液和6支标准工作液进液相色谱进行分析，可得呕吐毒素质量浓度，在此基础上求得猪饲料中呕吐毒素的最终含量。

2.7 呕吐毒素含量的计算公式

式中：X——饲料中呕吐毒素含量，mg/kg；

p——饲料测定液中呕吐毒素质量浓度，μg/mL；

V——饲料测定液最终定容体积，mL；

m——饲料称样量，g；

V1——提取液体积，mL；

V2——用于净化的溶液体积，mL。

3 结果与分析

3.1 不确定度来源分析

根据检测过程及呕吐毒素含量计算公式分析，认定呕吐毒素含量的不确定度来源主要是标准品工作液及配置、称量饲料、饲料均匀性、处理过程的饲料回收率、测量重复性、体积量取、定容和分析仪器引入的不确定度。

3.2 相对标准不确定度分量的分析

3.2.1标准品工作液及配置引入的相对标准不确定度

（1）标准品浓度引入的不确定度。不同厂家生产的标准物质浓度或纯度会有一些差异，因此由此所带来的不确定度也不同。该方法使用的是呕吐毒素标准品，标准证书上会标明呕吐毒素的浓度及误差。查找标准证书可知其纯度为0.996，最大允许误差为±0.004，按均匀分布计算，则浓度带来的标准不确定度U(c)和相对标准不确定度Urel(c)分别为：

（2）标准工作液配置引入的不确定度。在配置标准工作液过程中，使用的移液枪和容器等均存在误差。根据《化学分析中的不确定度的评估指南》（CNAS-GL06）[23]可分析不确定度来源，根据国家计量技术规范《测量不确定度评定与表示》[24]可知误差是怎样表示的，从而根据标准证书上的误差计算出工作液配置过程中所用容器引入的不确定度。

在配置中间标准溶液时，使用到的移液枪量程分别为200μL，1 mL，容量瓶体积为10 mL。根据《常用玻璃量具检定规程》和《移液枪检定规程》[25-26]的要求，可知1 mL的移液枪，它的最大允许误差为±0.01 mL。按均匀分布计算，可得其产生的不确定度U(V3)和相对标准不确定度Urel(V3)：

试验采用的10 mL容量瓶，由以上规程可知其最大允许误差为±0.02 mL。按均匀分布计算，可得其产生的不确定度U(V4)和相对标准不确定度Urel(V4)：

使用的200μL移液枪，由玻璃量具使用规程可知其最大允许误差为±3μL，按均匀分布计算，可得到其产生的不确定度U(V5)和相对标准不确定度Urel(V5)：

在整个试验操作过程中，室温变化会使液体体积发生变化，从而产生不确定度U(Vt)。因此计算室温变化产生的不确定度，可通过估计室温波动范围和此室温下体积膨胀系数计算，因液体膨胀系数远大于玻璃，所以玻璃的膨胀系数可忽略不计。实验室温度一般在±2℃范围变动[27-28]，溶剂以水为代表，液体膨胀系数在20℃时为a=2.1×10-4，则：

所以，标准工作液配置引入的不确定度Urel(V配置)为：

综上可知，标准品工作液及配置引入的不确定度Urel标准品为：

3.2.2 样品称量引入的相对标准不确定度

在样品称量过程中需要使用电子天平，根据JJG 98—1990《非自动天平检定规程》，使用最大允许误差为±0.01 g，感量为0.01 g的天平，不确定度按均匀分布计算，从而得到U(m)和Urel(m)分别为：

3.2.3 样品均匀性引入的相对标准不确定度

从饲料样品袋中取上下左右中间5个方位的样品，测定其呕吐毒素含量。测得呕吐毒素的含量分别为0.768，0.702，0.782，0.803，0.786 mg/kg，这5个含量的平均值A为0.768 mg/kg，标准偏差SA为3.90%。由计算可得样品均匀性引入的不确定度U(A)和相对标准不确定度Urel(A)分别为：

3.2.4 样品处理过程的回收率引入的相对标准不确定度

取不含呕吐毒素的空白猪饲料作为样品，向样品中添加一定含量的呕吐毒素，通过测定呕吐毒素的含量来计算回收率，再根据数学模型计算出回收率产生的不确定度。取5份10 g的饲料样品，加入含量为1.0 mg/kg的呕吐毒素。处理后测得呕吐毒素含 量 分 别 为0.916，0.842，0.896，0.839，0.901，0.890 mg/kg；回收率分别为91.6%，84.2%，89.6%，83.9%，90.1%，89.0%。平均回收率R为88.1%，标准偏差SR为3.20%，回收率引入的不确定度U(R)和相对标准不确定度Urel(R)分别为：

3.2.5 测量重复性引入的相对标准不确定度

称取一份10 g的空白饲料，加入含量为1.0 mg/kg的呕吐毒素，重复测定6次呕吐毒素含量，分别为0.916，0.923，0.916，0.916，0.905，0.921 mg/kg。平均值X=0.916 mg/kg，标准偏差SX为0.6%，U(X)和Urel(X)分别为：

3.2.6 体积量取引入的相对标准不确定度

根据JJG 196—2006，可知50 mL量筒的最大允许误差为±0.25 mL，U(V6)和Urel(V6)分别为：

根据JJG 646—2006，知5 mL移液枪的最大允许误差为±0.025 mL，U(V7)和Urel(V7)分别为：

由体积量取引入的合成相对不确定度为：

3.2.7 定容引入的相对标准不确定度

样品洗脱阶段，洗脱液用氮气吹干，用量程1 mL的移液枪往残留物中准确加入1 mL流动相溶解定容。由前述规程可知此移液枪的最大允许误差为±0.01。所以，在定容阶段引入的不确定度U(V定容)和Urel(V定容)分别为：

3.2.8 分析仪器引入的相对标准不确定度

试验所使用的分析仪器为LC/20A高效液相色谱仪，其扩展不确定度为10%，k=2（由山东省计量测试技术研究院出具的校准证书），则由液相色谱仪引入的相对标准不确定度Urel(E)为：

3.3 相对标准不确定度的合成及扩展

3.3.1 各相对标准不确定度分量汇总

相对标准不确定度分量表见表1。

表1 相对标准不确定度分量表

依据表1数据，可计算其合成各相对标准不确定度为：

合成不确定度为：

3.3.2 扩展不确定度

按k=2计算，其扩展不确定为：

测得此品牌猪饲料中呕吐毒素的结果表示为：

4 结论

采用液相色谱法测定猪饲料中的呕吐毒素，当饲料取样量为10.0 g，k=2（95%置信度）测得的呕吐毒素含量为0.768±0.0912 mg/kg。通过对各个不确定分量分析可以看出，标准品工作液及配置过程、体积量取过程和分析仪器是该方法不确定度的主要来源。通过评定试验过程的不确定度，可以有效地减少试验过程中的偏差，达到准确检测样品结果的目的。