苯乙双胍对体内外胰腺癌血管生成的抑制作用

骆锴冉，刘 岸

(1.绍兴文理学院附属医院 普外科，浙江 绍兴 312000；2.湖南理工学院 化工学院，湖南 岳阳 414000)

胰腺癌组织中的血管分布密度与胰腺癌的恶性生物学行为存在明显相关性，胰腺癌血供丰富[1]，已有诸多抗血管生成靶向药物如多靶点酪氨酸激酶抑制剂(索拉非尼)、VEGF/VEGFR单抗(阿西替尼)等应用于胰腺癌临床化疗，但胰腺癌患者对此类靶向药物多存在一定的毒性反应和耐药现象，使得胰腺癌患者的预后不理想[2]。抗糖尿病双胍类药物——苯乙双胍(phenformin)是一种高效的线粒体抑制剂[3]，在多种恶性肿瘤[4-5]中均表现出一定的抗癌活性，其抗肿瘤作用强于二甲双胍[6]。目前正在进行的一期临床试验(NCT03026517)旨在确定苯乙双胍联合小分子靶向药物(达拉非尼和曲美替尼)治疗黑色素瘤患者的最佳剂量，而苯乙双胍对恶性肿瘤血管生长的影响尚未探明。本研究观察苯乙双胍对体内外胰腺癌血管生成的抑制作用，并对其抗肿瘤的具体作用机制进行分析。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 HUVECs、人胰腺正常导管上皮细胞系HPDE6-C7和胰腺癌细胞系PANC-1购于美国模式培养物保存中心(ATCC)，苯乙双胍购自江苏千胜医药科技有限公司，VEGFA和Drabkin 525试剂盒购自美国Sigma公司，DMEM高糖培养基和胎牛血清购自杭州四季青生物科技有限公司，含EDTA胰蛋白酶购自中国吉诺公司，Matrix胶购自美国BD公司，细胞计数-8(CCK-8)试剂盒购自上海Biyuntian 公司，VEGFA、phospho-VEGFR2、Total-VEGFR2、phospho-ERK、Total-ERK和β-actin抗体均购自美国Epitomics公司。

1.2 细胞培养 所有细胞株均在含10%胎牛血清的DMEM培养液中和环境为37 ℃、5% CO2条件下进行培养，按照1∶3的比例进行传代。

1.3 CCK-8法 96孔板中每孔加入2×104个细胞，添加药物后37 ℃放置4 h，随后每孔添加10 μL CCK-8试剂，采用酶标仪检测450 nm处吸光值。

1.4 小管形成实验 将DMEM培养液和Matrigel胶分别于4 ℃放置12 h，成胶冻状后将DMEM培养液和Matrigel胶以1∶2的比例混合。24孔板中每孔加入250 μL混合后的Matrigel胶，37 ℃放置1 h待Matrigel胶凝结成块后，每孔加入0.1 mL密度为3×106/mL的HUVECs悬液。于37 ℃细胞培养箱中培养，采用光学显微镜(200×)观察小管形成状况。

1.5 蛋白质印迹法 采用细胞裂解液提取细胞蛋白，总蛋白经匀浆、离心、变性等操作后，电泳分离后同时转移至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉进行封闭操作，整体实验环境为4 ℃，维持12 h，硝酸纤维素膜分别经过一抗和二抗孵育(一抗和二抗体积稀释比例分别为 1∶1 000和1∶5 000)，利用显影定影试剂盒完成最后的显色和曝光操作。

1.6 裸鼠胰腺癌原位移植模型构建 参照文献[6]复制裸鼠胰腺癌原位移植模型。3～7周的BALB/c雌性小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXY(京)2016-0011)放置于层流净化屏障系统内饲养。将0.2 mL 密度为3×105/mL的胰腺癌PANC-1细胞悬液皮下注射到裸鼠的右下肢。注射2周后，处死裸鼠并取出皮下肿瘤组织，在显微镜下将肿瘤块修剪成2 mm×2 mm×2 mm大小。将肿瘤块原位移植到裸鼠胰尾部，2周后应用随机数字表法将20只胰腺癌原位移植模型裸鼠分为对照组和苯乙双胍组，每组10只。对照组裸鼠经灌胃给予0.2 mL 0.1%DMSO，苯乙双胍组裸鼠经食管插管给予苯乙双胍(1 mg/kg)，调整每次给药体积为0.2 mL，两组实验动物均2 d给药1次，持续2周，在移植术后第4周时处死裸鼠并摘除胰腺肿瘤。动物实验通过绍兴文理学院附属医院伦理委员会审核。

1.7 免疫组织化学法 样品用5%甲醛固定过夜，采用梯度乙醇脱水法将肿瘤组织脱水后包埋在石蜡中切片行SP染色。CD34阳性表达少数位于细胞质中，大部分表达于细胞膜中；VEGFA阳性表达大部分在细胞质中。随机选择20个视野并在低倍镜下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件分析VEGFA在样本中的积分光密度(IOD)值，在200×光学显微镜下选取10个视野，计数每个视野下CD34阳性细胞，取平均值。

1.8 血管造影 参照文献[6]对胰腺癌原位移植模型裸鼠实施明胶-氧化铅造影。采用腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉裸鼠，开胸后在裸鼠心尖处行长约1 mm切口，随即将24号留置针导管自切口插入，将明胶-氧化铅溶液自导管灌入裸鼠全身动脉，待明胶-氧化铅溶液凝固后取出胰腺肿瘤在X线下摄像。采用Quantity One 4.6.2(BIO-RAD)软件扫描X胶片中肿瘤内血管组织的光密度值，用排水法测定胰腺肿瘤体积。肿瘤组织光密度值与肿瘤体积(cm3)的比值为肿瘤组织平均体积血管密度。

1.9 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苯乙双胍对PANC-1、HPDE6-C7及HUVECs生长的影响 将0、0.001、0.01、0.1、1、10 μmol/L苯乙双胍分别作用于HPDE6-C7、PANC-1细胞及HUVECs。24 h后，较低浓度苯乙双胍(0.001、0.01、0.1 μmol/L)对HPDE6-C7细胞及HUVECs的生长无明显抑制作用，10 μmol/L苯乙双胍作用HPDE6-C7细胞及HUVECs 24 h后，细胞存活率从0 μmol/L苯乙双胍处理(100%)分别降低到(72.58±10.37)%和(79.51±8.96)%。0.01、0.1、1、10 μmol/L苯乙双胍处理PANC-1细胞后，细胞存活率均低于0 μmol/L苯乙双胍处理组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 苯乙双胍对HUVECs小管形成的影响 HUVECs在铺满Matrigel基质的培养板中生长12 h后，细胞逐渐向两端延长呈梭形，同时细胞延长端开始在Matrigel胶中伸展，相邻细胞开始出现联接并出现管腔样结构。0.001、0.01、0.1 μmol/L苯乙双胍作用HUVECs 12 h后体外小管形成数分别为25.4±4.8、20.3±3.7和18.6±3.5，均低于0 μmol/L苯乙双胍处理组(48.3±6.7) ，差异有统计学意义(P<0.001)。20 μg/L VEGFA联合0.1 μmol/L苯乙双胍作用HUVECs，12 h后体外小管形成数(57.6±6.4)高于0.1 μmol/L苯乙双胍处理组，差异有统计学意义(P<0.05)。见封三图1。

2.3 苯乙双胍对ERK/VEGFA/VEGFR2通路蛋白表达的影响 0.001、0.01、0.1 μmol/L苯乙双胍作用PANC-1细胞24 h后，VEGFA和p-ERK的表达水平随苯乙双胍浓度的升高而下降，见图2A。0.001、0.01、0.1 μmol/L苯乙双胍作用HUVECs 24 h后，可呈浓度依赖性抑制HUVECs中p-VEGFR2表达，见图2B。

图2 苯乙双胍对PANC-1细胞(A)和HUVECs(B)中ERK/VEGFA/VEGFR2通路蛋白表达的影响

2.4 苯乙双胍对胰腺癌原位移植模型裸鼠血管生长的影响 给药前及实验结束时，对照组和苯乙双胍组裸鼠体质量差异均无统计学意义(P>0.05)；苯乙双胍组胰腺肿瘤平均体积血管数量、肿瘤质量均少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。明胶-氧化铅血管造影结果显示，对照组胰腺肿瘤内血管分布较为密集，苯乙双胍组胰腺肿瘤质量较对照组减少，见封三图2 A、B。HE染色后在镜下可见对照组为低分化胰腺癌细胞，肿瘤中血供丰富；苯乙双胍组肿瘤细胞血供较为贫乏，可见大量组织坏死，见封三图2 C。免疫组化结果显示，对照组肿瘤组织中CD34、VEGFA阳性表达均高于苯乙双胍组，见封三图2 D。

表1 对照组和苯乙双胍组裸鼠体质量及胰腺肿瘤血管数量、质量的比较

3 讨论

苯乙双胍的抗癌机制包括抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和抑制细胞间充质上皮转化等[3-5]。但较高剂量的苯乙双胍有一定几率导致乳酸中毒等副作用，从而极大地限制苯乙双胍在临床中的使用。为此，本研究首先使用依次增高浓度的苯乙双胍分别作用体外胰腺癌PANC-1细胞、胰腺正常导管HPDE6-C7细胞和HUVECs，发现较低浓度(0.001～0.1 μmol/L)的苯乙双胍对体外HPDE6-C7细胞和HUVECs生长无明显抑制作用，但该浓度范围的苯乙双胍可有效抑制PANC-1细胞的生长。同时对HUVECs小管形成能力进行研究发现，即使使用最低浓度的苯乙双胍(0.001 μmol/L)也能对体外HUVECs发挥小管生成抑制作用，从而表明使用较低浓度的苯乙双胍可在对体外细胞无明显细胞毒作用的前提下有效抑制血管新生。体内实验也证实，较低剂量苯乙双胍(1 mg/kg)可在对裸鼠体重无明显影响的前提下抑制肿瘤血管新生和肿瘤生长，与体外实验结果相仿。从而首次通过体内外实验证实低浓度/剂量的苯乙双胍不但对正常细胞无明显影响，而且还能通过抑制肿瘤新生从而达到杀灭肿瘤细胞的效果，是一种极具临床应用前景的血管生成抑制剂。

定向靶向肿瘤血管内皮细胞的治疗可有效改善恶性肿瘤患者预后[7-8]。利用免疫组化检测CD34及VEGFA的阳性表达常用于评估组织的血管密度，本研究结果表明，苯乙双胍可有效抑制肿瘤组织中CD34及VEGFA的阳性表达，从而在微观层面表明苯乙双胍可有效抑制胰腺癌血管新生。本研究通过明胶-氧化铅对裸鼠胰腺肿瘤实施血管造影，从而获得较为直观的胰腺肿瘤血管灌注影像，X光下可见对照组胰腺肿瘤组织中充盈大量不透光的明胶-氧化铅，表明其丰富的血管网络。而苯乙双胍组胰腺肿瘤的X光下可见不透光的明胶-氧化铅大大减少，从而在宏观层面印证苯乙双胍可有效抑制体内胰腺肿瘤中的血管新生。

ERK信号通路对内皮细胞的迁移、分化和増殖等多种生理学功能发挥调控作用[9-10]。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是组织血管新生的有效促进因子，但在正常组织中的表达较为稳定，往往在肉芽组织和肿瘤组织等血管新生较为旺盛的组织中表达增加[11]。而ERK作为VEGFA的上游调控因子，在多种恶性肿瘤中已经证实ERK与VEGFA的密切联系[12]。在本研究体外实验中，苯乙双胍不仅可下调ERK的磷酸化水平在胰腺癌PANC-1细胞中的表达，还能有效抑制VEGFA的水平；同时在挽救实验中，添加一定浓度的VEGFA还可以有效逆转苯乙双胍对HUVECs的生物学功能；最后在体内实验中，不仅证实苯乙双胍可以抑制体内胰腺肿瘤血管新生，还能拮抗VEGFA在体内肿瘤中的表达水平。因此，本实验通过体内外实验证实ERK/VEGFA信号通路在苯乙双胍发挥肿瘤血管新生抑制作用中发挥了一定作用。研究表明，肿瘤细胞分泌VEGFA后需与位于内皮细胞表面的VEGF受体(VEGFR)结合，才能发挥血管新生作用[13]，VEGFA/VEGFR2信号轴已被证实在组织血管新生中发挥极为关键的调控作用。本研究的体外实验也证实苯乙双胍一方面可有效抑制VEGFA在胰腺癌细胞中的表达，另一方面还能拮抗VEGFR2的磷酸化水平在HUVECs中的表达。从而进一步揭示苯乙双胍抑制胰腺肿瘤中血管新生的作用机制。

综上所述，苯乙双胍在发挥抑制肿瘤血管新生过程中伴有ERK/VEGFA/VEGFR2通路的失活，本研究结果有望将苯乙双胍应用于临床胰腺癌治疗，作为临床胰腺癌化疗的“补充选择”。