子宫内膜样癌患者的阴道菌群特征及其功能预测

张 虎 冯 巧 朱展鹏 戴海燕 段迎春 胡 花

子宫内膜癌的发病率居中国女性恶性肿瘤的第6位，居生殖系统恶性肿瘤的第2位，在美国、欧洲及中国部分发达地区居首位[1]。近年来，子宫内膜样癌的发病率及相关死亡率均增高，我国子宫内膜样癌约占所有子宫内膜癌病例的70%，导致其医疗负担明显加重。与西方国家相比，中国子宫内膜样癌患者的5年生存率相对较低(中国为55.1%，美国为85.0%)[2]。因此，针对子宫内膜样癌的发生、发展机制及其影响因素的研究刻不容缓。仅从基因和环境因素尚不能完全阐明子宫内膜样癌的发生及发展机制。阴道菌群已被证实与卵巢癌、宫颈癌、胃肠道肿瘤等的发生相关。也有研究[3-4]发现，阴道阿托波菌和卟啉单胞菌与子宫内膜癌(包括子宫内膜样癌、黏液性癌、浆液性癌、鳞状细胞癌和癌肉瘤)的发生具有较显著的相关性。目前尚缺乏不同病理类型子宫内膜癌患者阴道菌群特征及可能作用机制的研究。本研究旨在分析子宫内膜样癌患者阴道菌群的特点，预测其可能参与子宫内膜样癌发生、发展的功能通路，为子宫内膜样癌无创筛查及发病机制研究提供新的角度。

1 对象与方法

1.1 研究对象 采用回顾性病例对照研究方法，收集2017年9月—2020年12月就诊于上海市浦东医院妇产科的35例超声检查提示子宫内膜异常增厚的患者临床资料及阴道分泌物标本，所有患者均通过诊断性刮宫或宫腔镜手术获取病理组织，由2位资深的病理科医师独立阅片并做出诊断，诊断结果一致，诊断为子宫内膜样癌或增殖期子宫内膜。患者的年龄为(51.63±8.69)岁，BMI为(25.44±4.24) kg/m2。将病理提示子宫内膜样癌的16例患者设为内膜样癌组，按2018年国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期，其中ⅠA期9例， ⅠB期2例，Ⅱ期2例，ⅢA、ⅢB及ⅢC1期各1例。将19例病理提示增殖期子宫内膜者设为对照组。纳入标准：①年龄为30～80岁子宫内膜样癌患者或异常子宫内膜增厚患者(绝经患者内膜增厚>5 mm，非绝经患者月经干净3 d后内膜厚度>10 mm)；②30 d内无局部或全身使用抗生素，7 d内无阴道给药及阴道冲洗；③生殖系统发育正常，无畸形，无生殖系统赘生物；④48 h内无性生活。排除标准：①妊娠期或哺乳期；②阴道炎症性疾病(外阴阴道假丝酵母菌病、滴虫性阴道炎等)；③6个月内有雌激素或雌激素类药物使用史、使用宫内节育器；④卵巢肿瘤、子宫肌瘤、宫颈良恶性疾病及其他恶性肿瘤；⑤自身免疫性疾病；⑥30 d内有泌尿生殖道手术史。本研究经医院伦理委员会审核并批准(批准号为QWJWXKJS.08)，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 阴道取样 在初次就诊时，询问患者病史并进行妇科检查，获取相关临床信息，明确是否符合纳入或排除标准，对所有纳入患者进行后续随访。入选当日对患者进行阴道样本取样，为避免样本污染，阴道扩张器以无菌0.9%氯化钠溶液润滑，扩张暴露宫颈后，用无菌棉签取阴道后穹隆部的分泌物，旋转擦拭10～15 s，采集后将阴道拭子立即放入无菌试管中，每例患者平行采集3份，编号后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 阴道微生物16S核糖体RNA(16S-rRNA)测序 ①细菌总DNA提取：收集患者冻存的阴道拭子标本，根据FastDNATMSPIN Kit for Soil试剂盒说明书进行总DNA抽提。②PCR扩增：采用PCR扩增法获得特异性目的基因片段，使用338F(5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)引物对V3至V4可变区进行PCR扩增(应用TransGen AP221-02：TransStartR FastPfu DNA Polymerase试剂盒，20 μL反应体系；PCR仪为ABI GeneAmp○R9700型)，使用AxyPrep DNA Gel Extraction试剂盒进行纯化，Tris-HCl缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测。应用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行定量检测，PCR扩增DNA浓度<0.2 g/L(浓度评级为C级)的样本予以剔除。③Illumina Miseq文库构建及测序：定量检测后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端；使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物；以Tris-HCl缓冲液洗脱，2%琼脂糖电泳检测；氢氧化钠变性，产生单链DNA片段，应用TruSeqTMDNA Sample Prep试剂盒进行文库制备，于Illumina MiseqPE300平台(上海美吉生物医药科技有限公司)进行测序。

1.2.3 数据处理 将测序得到的原始图像数据首先根据overlap关系进行拼接，同时应用Trimmomatic软件对序列质控，Flash软件进行拼接,区分样本后应用UPARSE软件进行操作分类单元(OTU)分析；应用RDP classifier 2.11和Uparse 7.0.1090分析软件，分别对OTU代表序列进行物种分类学分析和聚类分析，应用Qiime 1.9.1软件生成各分类学水平丰度表，多样性距离计算，Mothur1.30.2软件进行多样性分析，PICRUSt1.1.0软件用于16S序列的蛋白质直系同源簇信息(clusters of orthologous groups of proteins，COG)功能预测。

1.2.4 阴道微生物组学差异性分析 进行阴道微生物α多样性分析、β多样性分析，以及微生物的功能预测分析。微生物α多样性主要反映组内微生物种类的多样性和丰富度，指标包括Shannon指数、Simpson指数、Chao指数、ACE指数、Coverage指数。β多样性主要反映组间微生物组成的差异，采用非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析，NMDS分析的距离算法采用Bray_Curtis，组间差异采用ANOSIM分析。微生物的功能预测分析通过PICRUSt 1.1.0软件基于高通量测序结果与COG数据库进行比对，寻找组间差异富集的功能通路。

1.3 观察指标 比较两组患者的一般资料，包括年龄(<52岁、≥52岁)，BMI(<25.44 kg/m2、≥25.44 kg/m2)，是否绝经，有无高血压、糖尿病病史，分娩次数(1、2、>2次)，流产次数(0、1、>1次)，性生活频率(<4次/月、≥4次/月)。记录并比较两组阴道微生物α多样性分析结果、群落组成情况、β多样性分析结果，以及阴道微生物的功能预测分析结果。

2 结 果

2.1 两组患者的一般资料比较 两组间患者的年龄、BMI，绝经、高血压、糖尿病人数，以及分娩次数、流产次数、性生活频率的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 两组患者一般资料的比较 (n)

2.2 两组阴道微生物α多样性分析结果比较 两组间Shannon指数、Simpson指数、Chao指数、ACE指数和Coverage指数的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。

表2 两组阴道微生物α多样性分析结果的比较

2.3 两组阴道微生物群落组成情况比较 本研究列出了在菌属丰度排名前23位的微生物，两组中相对丰度最高的细菌均为乳酸杆菌属。内膜样癌组菌属相对丰度居前10位由高至低依次为乳酸杆菌属(31.16%)，普氏菌属(16.60%)，厌氧菌属(6.03%)，链球菌属(4.77%)，解脲支原体(3.62%)，加德纳菌属(3.32%)，嗜胨菌属(2.90%)，消化链球菌属(1.90%)，卟琳单胞菌属(1.86%)，不动杆菌属(1.86%)。对照组菌属相对丰度居前10位由高至低依次为乳酸杆菌属(15.80%)，加德纳菌属(15.39%)，普氏菌属(11.8%)，奇异菌属(9.15%)，厌氧菌属(7.33%)，韦荣球菌属(4.22%)，肠球菌属(3.54%)，纤毛菌属(2.64%)，芬格尔德菌属(1.93%)，卟琳单胞菌属(1.78%)。见图1。内膜样癌组加德纳菌属相对丰度(3.32%)显著低于对照组(15.39%，P=0.03)，两组间其余菌属相对丰度的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

图1 两组阴道微生物群落组成情况

2.4 两组阴道微生物β多样性分析结果比较 NMDS分析结果显示，内膜样癌组与对照组样本空间分布比较接近，重合度高，表明两样本物种组成相似，提示两组间β多样性的差异无统计学意义(P=0.32)，且Stress(观察到的距离与拟合的距离不一致性)=0.19，故此分析可靠。见图2。

图2 NMDS分析图

2.5 两组阴道微生物的功能预测分析 通过PICRUSt1.1.0软件基于高通量测序结果与COG数据库比对的结果显示，内膜样癌组次生代谢物生物合成运输与分解代谢、细胞运动的功能丰度值分别为190 899.88±11 187.84、136 818.06±11 248.72，均显著高于对照组的115 730.86±3 542.88、47 544.90±2 647.83(P值均<0.01)。

3 讨 论

本研究通过16S-rRNA测序及生物信息学分析结果显示，内膜样癌组加德纳菌属相对丰度显著低于对照组，次生代谢物生物合成运输与分解代谢、细胞运动的功能丰度值均显著高于对照组，揭示了子宫内膜样癌患者阴道菌群组成特点，即阴道加德纳菌属相对丰度显著降低，次生代谢生物合成运输与分解代谢系统、细胞运动系统的功能显著增强。本研究结果显示，两组间Shannon指数、Simpson指数、Chao指数、ACE指数和Coverage指数的差异均无统计学意义，表明两组间患者阴道菌群多样性和丰富度基本一致。

子宫内膜样癌患者阴道菌群主要为乳酸杆菌属、普氏菌属及厌氧球菌属。虽然阴道乳酸杆菌仍为优势菌，但其相对丰度<40%，其他菌群相对丰度则相应增高。本研究纳入的患者多处于围绝经期或绝经期，不同于育龄期妇女的阴道微生物特点；大多研究[5-8]发现，围绝经期和绝经期人群乳酸杆菌相对丰度呈下降趋势，部分患者乳酸杆菌属不再是优势菌群，而加德纳菌属、普氏菌属和奇异菌属等相对丰度呈上升趋势。另有研究[9]结果显示，绝经后正常妇女阴道乳酸杆菌属并未显著减少或消失，考虑该结果与上述研究结果不同的原因为纳入研究对象存在差异。子宫内膜样癌患者和增殖期子宫内膜者临床上常表现为异常子宫出血，既往研究[10]也发现异常子宫出血的患者阴道普氏菌属相对丰度增高，与本研究发现相似。本研究中仍有较多菌群未能明确，提示16S-rRNA测序法虽可检测出已知的大部分菌群，但方法仍需进一步改进。

本研究结果显示，子宫内膜样癌患者阴道加德纳菌属相对丰度较对照组显著下降，表明阴道加德纳菌可能与子宫内膜样癌相关。加德纳菌属是阴道常见共生菌群之一，可分泌唾液酸酶。有研究[11]结果发现，哺乳动物的唾液酸酶包含4种类型，分别为神经氨酸酶(NEU)1、NEU2、NEU3和NEU4，在多种肿瘤中异常表达，参与肿瘤细胞的增殖分化、细胞凋亡、侵袭、转移等过程。但4种唾液酸酶在子宫内膜样癌中起作用的亚型及调控机制尚未被阐明。本研究结果显示，内膜样癌组加德纳菌属相对丰度显著低于对照组，推测唾液酸酶含量也随之降低，在4种类型神经氨酸酶的相互作用下导致体内唾液酸酶异常，从而参与子宫内膜发生癌变。加德纳菌产生的细菌毒素和代谢产物也可能参与宿主表观遗传染色质重塑，下调或上调与正常细胞周期和肿瘤抑制有关的关键基因产物，但目前均缺乏其在子宫内膜癌中的研究。Walther-António等[4]研究发现，阴道阿托波菌和卟啉单胞菌与子宫内膜癌的发生相关，但本研究结果未显示内膜样癌组与对照组阴道卟啉单胞菌属相对丰度的差异有统计学意义，可能受内膜癌的病理类型、人种、肿瘤分期不同等影响。阴道加德纳菌属相对丰度的改变可能为子宫内膜样癌的阴道微生物表现之一。子宫内膜样癌是雌激素依赖型，在无孕激素拮抗的雌激素长期作用下发生。围绝经期或绝经后妇女由于雌激素水平下降，导致阴道加德纳菌属相对丰度增高，但子宫内膜样癌患者体内无孕激素拮抗的雌激素刺激可能导致子宫内膜样癌患者的阴道乳酸杆菌属相对丰度增高，进而使阴道加德纳菌属相对丰度下降[12-13]。

本研究结果显示，内膜样癌组次生代谢物生物合成运输与分解代谢、细胞运动的功能丰度值均显著高于对照组。细胞运动能力的获得是肿瘤细胞具有侵袭表型的一个关键特性，细胞运动可通过细胞外信号调节激酶(ERK)-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Rho鸟苷三磷酸酶(Rho GTPase)等通路进行信号传导；细胞运动和侵袭对ERK信号的需求可能取决于相关基因改变[14]。微生物次生代谢物生物合成运输与分解代谢产物包括有毒的代谢物，这些代谢物的循环可能在远离特定微生物的地方导致肿瘤的发生或发展。已有研究[3]证实，微生物代谢产物与胃肠道肿瘤、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌等肿瘤发生风险增加相关。由于细菌种类多且复杂，鉴定导致肿瘤发生的微生物或细菌产物仍具有挑战性，破译特定细菌产物在肿瘤发生和发展中的作用仍处于初级阶段。

综上所述，子宫内膜样癌患者阴道菌群具有特异性，其中阴道加德纳菌属相对丰度降低，为未来基于阴道菌群理论实现子宫内膜样癌无创筛查提供可能；子宫内膜样癌患者次生代谢物生物合成运输与分解代谢系统、细胞运动系统的功能显著增强，为进一步研究奠定基础。有关子宫内膜样癌患者的阴道微生物群研究处于起步阶段，许多关键问题仍有待进一步探索，基于信息收集和描述性研究进而构建子宫内膜样癌患者阴道微生物全景图尤为必要。