线粒体三磷酸腺苷敏感钾离子通道在大鼠心肺复苏后急性肾损伤中的作用研究

田 磊 王世伟 赵 立 杨 倩 陆晓晔 朱长清 杨伟强

复苏后综合征(post-resuscitation syndrome，PRS)是心脏骤停患者心肺复苏成功后死亡的主要原因，多器官功能障碍是其常见表现，系统性缺血再灌注损伤是其主要病理机制[1-2]。急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是心肺复苏后常见的脏器功能损伤，发病率>50%，是患者心肺复苏成功后死亡的独立危险因素[3-4]。研究心肺复苏后患者发生AKI的防治策略具有重要的临床意义。

ATP敏感钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel, KATP)可调节微循环障碍，能够改善缺血再灌注损伤[5]。KATP主要分为两类，一类为肌膜KATP (sarcolemmal KATP，sarcKATP)，另一类为线粒体KATP(mitochondrial KATP，mitoKATP)。本课题组前期研究[6]结果显示，非选择性KATP激动剂左西孟旦对心肺复苏后发生AKI的大鼠具有显著的保护作用。然而，左西孟旦主要通过何种KATP发挥作用，尚未完全明确。Grossini等[7]的一项关于缺血再灌注肾损伤的动物实验结果显示，mitoKATP在肾损伤的治疗中具有重要作用 。本研究将通过构建心脏骤停-心肺复苏动物模型，探索mitoKATP在心肺复苏后AKI中的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由中山大学孙逸仙纪念医院唐万春危重症实验室提供无特定病原体(SPF)级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠50只，体重为(510.0±6.6) g。实验用动物生产许可证编号SCXK(粤)2013-0034，动物使用许可证编号SYXK(粤)2017-0081。所有SD大鼠适应性饲养1周后进行实验。

1.2 试剂与仪器 戊巴比妥购自美国Sigma-Aldrich公司，左西孟旦购自中国齐鲁制药有限公司，mitoKATP抑制剂5-HD购自美国Sigma-Aldrich公司，sarcKATP抑制剂HMR-1098购自德国赛诺菲-安万特公司，血清肌酐(sCr)和尿素氮(BUN)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，多炎症因子检测Bio-Plex试剂盒购自美国伯乐公司，丽春红和酸性品红购自上海试剂三厂，线粒体复合物酶活性定量检测试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司，兔抗大鼠GAPDH、剪切的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase 3)单克隆抗体购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3 心脏骤停-心肺复苏动物模型建立及分组处理 将SD大鼠随机分为左西孟旦治疗(levo)组、mitoKATP激动(mito)组、sarcKATP激动(sarc)组、空白对照组(control)组和假手术(sham)组，每组各10只。

大鼠在实验前12 h禁食，采用3%戊巴比妥按照45 mg/kg浓度行腹腔内注射麻醉，术中间断予以10 mg/(kg·h)静脉麻醉。对大鼠右侧股动脉和静脉予以置管，监测血压和静脉给药通路，二导联心电监护记录大鼠心电变化。levo组、mito组和sarc组大鼠采用封堵气管插管的方法，制造窒息环境，同时监测大鼠心率和心电变化。当平均动脉压≤20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)时，记作心脏骤停，并再重新计时6 min。在大鼠心脏骤停5 min 30 s时，予以吸痰并行呼吸机通气，通气频率200次/min，氧浓度100%。心脏骤停6 min时，立即于剑突上2.8 cm行胸外按压，按压频率200次/min，按压深度1 cm，按压过程维持冠状动脉灌注压(22±2) mmHg。复苏后平均动脉压≥60 mmHg，持续5 min，视为自主循环恢复。持续按压20 min，仍不能恢复自主心律，视为复苏失败。sham组大鼠仅予置管，记录各项指标，不进行心肺复苏操作。

levo组、mito组和sarc组大鼠在心脏骤停5 min 30 s时，予快速静脉注射左西孟旦12 μg/kg，复苏后予以0.3 μg/(kg·min)静脉维持。mito组在左西孟旦给药前予3 mg/kg HMR-1098静脉注射；sarc组在左西孟旦给药前予5 mg/kg 5-HD 静脉注射；control组和sham组在相同时间点注射等剂量0.9%氯化钠溶液。

1.4 肾功能及炎症指标检测 大鼠心肺复苏后6 h经股静脉采血，300×g离心10 min，留取血清。应用试剂盒检测各组大鼠sCr和BUN水平。同时，通过多炎症因子Bio-Plex试剂盒检测血清IL-1β、IL-6和TNF-α 水平。

1.5 肾组织病理检查 大鼠心肺复苏后6 h，以苯巴比妥腹腔内注射麻醉，取其左侧肾脏，甲醛固定，常规石蜡包埋。制作5 μm石蜡切片，行H-E染色。200倍光镜下观察各组大鼠肾组织病理学改变。采用Jablonski评分标准对肾脏H-E染色切片进行形态学评估[8]。判断标准：随机挑选10个以上包括皮质和外髓质在内的高倍镜视野，计算每个视野中受损肾小管的百分比并行病理评分，取均值。病理评分标准：正常肾小管计0分；肾小管损伤程度≤25%计1分；肾小管损伤程度26%～50%计2分；肾小管损伤程度51%～75%计3分；肾小管损伤程度≥76%计4分。

1.6 采用分光光度法检测肾组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性 取各组大鼠肾脏组织，称重并按重量体积比(1∶5)加入Tris-HCl缓冲液匀浆，制成10%的组织匀浆液，2 000×g、15 min低温离心2次，弃沉淀，将2次所得上清液混合，12 000×g、15 min低温离心2次，弃上清液所得沉淀制成线粒体悬浮液。采用比色法测定线粒体呼吸链复合物 Ⅰ、Ⅱ活性。在20 μL线粒体悬浮液中加入反应缓冲液(10 mmol Tris-HCl，pH值为8.0)，随后分别加入辅酶Q(80 μmol)、小牛血清白蛋白(BSA, 1 mg/mL)、叠氮钠(NaN3，0.25 mmol)、抗霉素A(0.4 μmol)，混匀后37 ℃孵育3 min，再加入NADH 200 μmol启动反应。3 min内连续测定波长为340 nm处NADH吸光度(A)的变化[摩尔吸光系数ε=3.3 L/(mmol·cm)]，根据每分钟A340 nm值的变化评估线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性。将20 μL线粒体悬浮液加入pH值为7.4的 50 mmol磷酸钾缓冲液，随后分别加入二氯酚靛酚(50 μmol)、NaN3(2 mmol)、鱼藤酮(2 μg/mL)、抗霉素A(2 μg/mL)、辅酶Q(25 μmol)，混匀后37 ℃孵育3 min，再加入琥珀酸钠(20 μmol)启动反应。3 min内连续测定波长为600 nm处A的变化[摩尔吸光系数ε=13.0 L/(mmol·cm)]，根据每分钟A600 nm值的变化评估线粒体呼吸链复合物Ⅱ的活性。

1.7 免疫印迹实验 取大鼠肾组织，匀浆，提取蛋白质，进行浓度定量。各组取50 μg蛋白质经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至聚偏二氟乙烯膜上，室温封闭1 h 后分别与兔抗大鼠GAPDH和cleaved caspase 3抗体(稀释度1∶1 000)结合，洗膜后再结合辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗抗体(1∶5 000 TBST稀释)，增强化学发光显影试剂反应后，应用免疫印迹自动成像仪扫描并获得显影图像。应用Image J软件分析蛋白质的灰度值。

2 结 果

2.1 mitoKATP开放可改善心肺复苏后大鼠肾功能 与sham组[sCr水平为(16.89±1.27) μmol/L，BUN水平为(2.77±0.15) mmol/L]比较，control组大鼠心肺复苏6 h后sCr和BUN水平分别为(81.81±2.48) μmol/L和(6.84±0.28) mmol/L，均显著升高(P值均<0.05)，提示大鼠心肺复苏后出现AKI。与control组比较，levo组sCr水平为(33.25±1.03) μmol/L、BUN水平为(4.34±0.27) mmol/L，mito组sCr水平为(35.23±0.85) μmol/L、BUN水平为(4.51±0.29) mmol/L，均显著降低(P值均<0.05)；而sarc组sCr和BUN水平分别为(80.50±3.50) μmol/L和(6.47±0.32) mmol/L，其差异均无统计学意义(P值均>0.05)。上述结果提示，左西孟旦能够改善心肺复苏后大鼠肾功能，mitoKATP开放可能起主要作用。见图1。

与sham组比较：①P<0.05。与control组比较：②P<0.05。A 各组大鼠sCr水平比较 B 各组大鼠BUN水平比较图1 各组大鼠肾功能的比较

2.2 mitoKATP开放能够减轻心肺复苏后大鼠肾组织病理损伤程度 H-E染色结果显示，与sham组比较，control组大鼠肾小管结构破坏明显，管腔内管状缘、刷状缘脱离，大量管型形成。与control组比较，levo组和mito组肾小管轻度扩张，管型明显减少；而sarc组大鼠肾组织结构变化与control组相似。见图2。病理评分结果显示，与sham组的(0.30±0.14)分比较，control组为(3.60±0.22)分，显著升高(P>0.05)。与control组比较，levo组和mito组分别为(2.60±0.16)和(2.80±0.20)分，均显著降低(P值均<0.05)；sarc组为(3.50±0.30)分，与control组比较的差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果提示，左西孟旦能够改善心肺复苏后大鼠肾组织病理损伤，mitoKATP开放起重要作用。

A sham组 B control组 C levo组 D mito组 E sarc组图2 各组大鼠肾脏组织病理改变的比较(H-E染色，×200)

2.3 mitoKATP开放能够降低心肺复苏后大鼠血清炎症因子水平 与sham组比较，control组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α 水平显著升高(P值均<0.05)；levo组和mito组IL-1β、IL-6和TNF-α 水平较control组显著降低(P值均<0.05)，而sarc组与control组间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。上述结果提示，左西孟旦能够改善炎症反应，mitoKATP开放起重要作用。

表1 各组大鼠血清炎症因子表达情况的比较

2.4 mitoKATP开放能够改善心肺复苏后大鼠肾组织细胞凋亡 免疫印迹实验结果显示，与sham组(肾组织cleaved caspase 3相对表达量为0.16±0.01)比较，control组肾组织cleaved caspase 3相对表达量(0.77±0.01)显著增加(P<0.05)；与control组比较，levo组和mito组肾组织cleaved caspase 3相对表达量分别为(0.37±0.01)和(0.39±0.01)，均显著减少(P值均<0.05)， 而sarc组肾组织cleaved caspase 3相对表达量(0.77±0.02)，其差异无统计学意义(P>0.05)。 见图3。上述结果提示，左西孟旦能够改善肾组织凋亡，mitoKATP开放起主要作用。

1 sham组 2 control组 3 levo组 4 mito组5 sarc组图3 各组大鼠肾组织cleaved caspase 3蛋白质表达情况

2.5 mitoKATP开放能够改善心肺复苏后大鼠线粒体功能 与sham组比较，control组、levo组、mito组、sarc组线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性均显著受到抑制(P值均<0.05)；与control组比较，levo组和mito组线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性均显著增强(P值均<0.05)，而sarc组线粒体呼吸链复合物活性其差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。上述结果表明，左西孟旦能够改善心肺复苏后大鼠肾组织线粒体功能，mitoKATP开放可能起重要作用。

表2 各组大鼠线粒体功能比较

3 讨 论

缺血再灌注损伤是心肺复苏后AKI的主要病理机制[5，9-10]。多个围绕心肌细胞缺血再灌注损伤的研究[5,11-12]证实，激活KATP能够改善心肌细胞缺血再灌注损伤。Yurdakul等[13]的研究结果显示，KATP开放能够改善肾脏缺血再灌注损伤。一项多中心随机对照双盲临床研究[14]结果显示，非选择性KATP激动剂左西孟旦能够预防CKD患者接受二尖瓣置换术后AKI的发生。本研究发现，左西孟旦能够改善心肺复苏后大鼠肾功能，这与以往的研究结果一致。同时，本研究分别采用mitoKATP和sarcKATP抑制剂进行干预，并进一步发现左西孟旦主要是通过激活mitoKATP发挥肾脏保护作用。这提示mitoKATP在大鼠心肺复苏后的AKI中起重要作用。

肾脏是人体除大脑之外氧耗最多的器官，线粒体与肾脏缺血再灌注损伤有密切关联[15]。mitoKATP参与维持正常的线粒体功能[16]。关于帕金森病的基础研究[17]结果显示，mitoKATP参与调节线粒体动力学。近期一项关于心脏缺血再灌注损伤的研究[18]提示，异氟烷能够通过开放mitoKATP以调节线粒体呼吸链进而发挥脏器保护作用。本研究发现，心脏骤停大鼠心肺复苏后，肾组织中线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性明显下降，提示心肺复苏后大鼠肾组织线粒体呼吸链受损。mitoKATP开放后线粒体呼吸链复合物活性得以改善，大鼠肾损伤也得到缓解，提示mitoKATP可能通过调节线粒体功能进一步改善大鼠心肺复苏后的AKI。

炎症因子参与PRS，大量炎症因子释放介导心肺复苏后缺血再灌注损伤的发生，其中IL和TNF起重要作用[19]。一项关于大鼠缺血再灌注所致AKI的研究[20]显示，成纤维细胞因子2能够改善5-HD对mitoKATP的抑制作用，进而降低肾组织炎症因子(IL-1、IL-6和TNF-α)表达水平，发挥肾脏保护作用。该研究结果提示，mitoKATP可能参与炎症调节。本研究发现，心肺复苏后AKI大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高，左西孟旦能够降低血清炎症因子水平，而mitoKATP开放起主要作用。本研究结果与既往的研究结论基本一致。

细胞凋亡在AKI的发生中起重要作用[21]。mitoKATP与凋亡的关系已有多个报道。一项关于吸烟与中枢感受器受损的研究[22]结果表明，mitoKATP开放能够降低凋亡相关蛋白质表达水平，抑制凋亡发生。Arabian等[23]关于缺血再灌注引起海马损伤的研究结果显示，mitoKATP开放能够抑制细胞凋亡，进而发挥神经保护作用。本研究结果发现，mitoKATP开放能够抑制cleaved caspase 3蛋白质的表达，改善大鼠心肺复苏后AKI。结合以往的研究，本课题组推测mitoKATP开放具有抗凋亡作用。

综上所述，mitoKATP开放能够抑制炎症反应，减轻肾组织细胞凋亡，改善肾脏线粒体功能，进而缓解大鼠心肺复苏后AKI。mitoKATP有望成为心肺复苏后AKI的防治靶点。