食管内镜黏膜下剥离术后食管狭窄的防治研究进展

冉桃菁 周春华 张 玲 张敏敏 邹多武

内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection，ESD)可实现局部肿瘤或化生黏膜的整体切除，已成为早期食管癌或癌前病变的标准治疗方法。与内镜黏膜切除术相比，ESD能将病变部位整体切除，复发风险低，但ESD术后出血、穿孔、食管狭窄等并发症的发生率较高。随着早期食管癌和巴雷特食管内镜切除手术的增多[1]，以及黏膜下剥离面积的扩大[2]，术后37%～92%的患者会出现严重的食管狭窄，导致吞咽困难，严重影响其生活质量[3]。因此，如何防治术后食管狭窄已成为一个重要的临床挑战。研究[4]结果表明，病变切除周长和浸润深度是ESD术后食管狭窄的2个独立危险因素，病变切除>3/4食管周长的患者中有90%会出现ESD术后食管狭窄[5-6]。故针对食管ESD术后食管狭窄高发的现状，深入探讨其发生、发展机制，并进一步探讨其防治技术尤为重要。

1 食管ESD技术发展的困惑

虽然目前食管ESD是治疗早期食管癌及合并高度不典型增生的巴雷特食管的有效手段，但ESD技术本身及术后管理的复杂性增加了其术后并发症的发生风险，食管狭窄是环周ESD术后最常见的并发症[7]。内镜引导下球囊扩张、自膨式金属支架植入、局部注射或口服糖皮质激素等预防和治疗ESD术后食管狭窄的传统方法，存在疗程较长等缺陷或可发生严重不良事件的潜在风险[5]。

反复的内镜引导下球囊扩张操作会增加患者痛苦，且存在出血、穿孔等风险[8]。糖皮质激素具有一定抗炎、抗纤维化的作用，但口服糖皮质激素治疗会导致免疫抑制、糖尿病、精神障碍、消化性溃疡和骨质疏松症等全身性不良事件发生，而局部注射糖皮质激素可能会导致迟发性穿孔、出血和纵隔气肿发生，因此需慎重选用糖皮质激素治疗[9]。自膨式金属支架植入是治疗食管狭窄的另一种选择，然而植入的支架需要移除，且支架移位和脱落的发生常使其应用复杂化[10]。鉴于上述治疗手段存在各种缺陷，目前越来越多的研究致力于新的治疗方法的探索和研发。

2 ESD术后食管狭窄的发生机制

食管ESD术后溃疡愈合过程中形成狭窄的原因尚不完全清楚。目前的研究[11]认为，术后创面早期募集大量炎症细胞和成纤维细胞，中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞释放TNF-α、TGF-β和IL-1β等多种细胞因子，这些细胞因子可将成纤维细胞激活为肌成纤维细胞，后者可产生细胞外基质(如胶原)，促进纤维化的形成导致食管黏膜层破坏，上述过程导致溃疡创面收缩而形成食管狭窄。基于上述理论，减少炎症反应、加速上皮再生速度、降低对黏膜肌层的损伤可有效防治食管ESD术后食管狭窄的发生[12]。

3 针对ESD术后食管狭窄的研究策略

在解剖学和生理学上，猪和犬的消化系统与人类颇为相似，是消化系统疾病研究的理想模型之一[13-14]。目前，已有大量研究以猪或犬作为实验动物，行食管全周或半周ESD术，并在术后不同时间点予不同新型生物材料或药物干预，评估这些干预措施对ESD术后食管狭窄的预防及治疗作用，部分研究成果成功应用于人体。目前采取的干预措施主要分为3类：类组织细胞工程材料、生物制剂黏膜下注射和细胞组织移植。

3.1 类组织细胞工程材料 组织生物工程作为生物医学领域一门新兴且发展迅速的学科，将生物学和工程学相结合，在体外模拟组织再生条件修复损伤组织。目前，已有大量研究利用其良好的材料-细胞界面相容性和生物学活性，将生物支架、细胞补片等用于ESD术后食管狭窄的预防及治疗。脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix，ADM)作为一种生物支架，在保留生物力学特性(胶原支架和基底膜)的同时去除了潜在的免疫原性物质，能够促进组织重塑，减少排异反应。Han等[15]将牛皮来源的ADM采用生物工程的方法进行灭菌和脱细胞处理后制成ADM支架，并于ESD术后直接将ADM支架用夹子固定于创面，发现ADM支架植入后食管狭窄的发生率(17.2%比39.8%，P=0.01)、吞咽困难的严重度(Mellow-Pinkas狭窄评分0.7比2.0，P=0.03)、体重下降的程度(-0.9 kg比-4.1 kg，P=0.007)均显著低于对照组，病变组织中性粒细胞浸润程度也显著低于对照组(355.6/高倍镜视野比517.0/高倍镜视野，P=0.02)。但生物支架存在难以固定的缺点，需缝合或黏合剂才可将其固定。目前ADM在泌尿系统疾病所致的尿道狭窄中已有临床应用，但在食管ESD术后的应用尚缺乏相关临床数据。

与生物支架相比，细胞膜片因保留了细胞膜蛋白和细胞外基质，可以更快速、方便地黏附到食管黏膜。目前已通过动物实验验证的组织细胞工程膜片主要有脂肪源性基质细胞(adipose tissue-derived stromal cell，ADSC)双层膜片、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose，CMC)膜片和犬口腔黏膜上皮细胞(oral mucosal epithelial cell，OMEC)膜片等。ADSC具有局部免疫调节、细胞募集和促进新生血管形成等旁分泌活性，可调节角质细胞和成纤维细胞的相互作用，通过抑制过度纤维化提高再生组织质量。Perrod等[16]对实验动物行食管半周ESD术，并通过组织细胞工程方法从供体母猪腹部皮下脂肪中分离重建ADSC双层细胞膜，ADSC组动物ESD术后立即覆盖ADSC膜，结果发现ADSC组动物出现吞咽困难及内镜下狭窄的比例低于对照组(17%比80%，P=0.08；17%比100%，P=0.015)；组织病理学分析发现，ADSC组纤维化程度低于对照组(纤维化面积9.7 mm2比26.1 mm2，P=0.017；纤维化深度1.6 mm比3.2 mm，P=0.052)。CMC膜片是一种由透明质酸和CMC组成的生物可吸收膜，在瘢痕形成过程中，CMC膜片可降低成纤维细胞的活性，抑制炎症反应，从而最大限度地减少瘢痕挛缩发生。Tang等[17]对实验小猪行全周ESD术，术后创面立即覆盖CMC膜片，发现在术后第14天CMC组食管黏膜狭窄率(53.0%比72.1%，P<0.001)、黏膜下最大纤维化厚度(1.01 mm比1.54 mm，P=0.001)均显著低于对照组。但Lua等[18]对肿瘤周长>食管周径1/2、纵向长度>4 cm的食管ESD术后患者应用CMC薄片覆盖术后黏膜缺损，术后食管狭窄发生率为57%，表明单用CMC膜片不足以预防食管ESD术后狭窄。

细胞膜片相关研究揭示了其在预防食管ESD术后食管狭窄的潜能，但其耗时长、制作步骤烦琐，研究者开始关注直接涂抹或口服相关生物制剂的方法。自组装肽(self-assembling peptide)是含天然氨基酸的多肽分子，具有序列设计灵活、化学合成方便、生物相容性好等优点。通过改变多肽的氨基酸序列，目前已设计出了众多具有特殊功能的纳米自组装材料应用于组织工程、药物缓释及生物材料等领域。Oumrani等[19]对实验动物ESD创面直接涂抹3.5 mL自组装肽基质，发现自组装肽组体重变化幅度(+1.6 kg比-3.8 kg，P=0.017)显著小于对照组，内镜下评估自组装肽组食管管腔直径显著大于对照组(9.5 mm比4.0 mm，P=0.004)。组织病理学上自组装肽新生上皮组织的长度显著长于对照组(3 075 μm比1 155 μm，P=0.014)。羊膜间充质干细胞(amnion-derived mesenchymal stem cell，AMSC)是一种有分化能力的多能细胞，可通过分泌各种生长因子和抗炎分子来改善受损组织。Mizushima等[20]提取人胎盘AMSC培养液，通过口服的方式研究了其在ESD术后急性期和慢性期对创面的影响。每周口服和每天口服AMSC的实验组食管狭窄发生率均显著低于对照组(56.3%、52.7%比80.0%，P<0.05)，与糖皮质激素组(49.3%)相当。使用AMSC溶液的实验组纤维厚度显著小于对照组(833 μm、987 μm比1 609 μm，P<0.05)。在炎症急性期(第1～8天)，AMSC组浸润的中性粒细胞(30/高倍镜视野比70/高倍镜视野，P<0.01)和巨噬细胞(12/高倍镜视野比32/高倍镜视野，P<0.01)均显著少于对照组。

3.2 生物制剂黏膜下注射 组织细胞工程相关研究揭示了其在预防食管ESD术后食管狭窄的潜能，但其存在制作烦琐、耗时且生产和保存成本较高的缺点，于是学者们逐步关注到可直接黏膜下注射的生物制剂的研发。胸腺素受体β4(thymosin β4，Tβ4)具有促进新生血管生成、内皮迁移、调节炎症反应和抑制纤维化的作用。Wang等[21]分别于ESD术后即刻和第3天在实验动物黏膜下注射20 mL Tβ4凝胶，发现Tβ4组因发生狭窄而需行内镜引导下球囊扩张治疗的次数显著少于对照组(8.50次比17.25次，P=0.002)。碳水化合物硫转移酶15(carbohydrate sulfotransferase 15，CHST15)是一种由成纤维细胞表达的Ⅱ型跨膜高尔基蛋白质，参与小鼠结肠炎和心肌炎的纤维化过程。Sato等[22]在猪食道的口侧端和肛侧端分别行半周ESD术，选其中1个部位予黏膜下注射CHST15小干扰RNA，术后第14天发现CHST15小干扰RNA未干预侧创面组织纤维化、CHST15 mRNA表达增加，而CHST15小干扰RNA干预侧胶原蛋白沉积和成纤维细胞积累较少，纤维化相关分子TGF和Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达也减少。CHST15小干扰RNA干预可减轻ESD术后溃疡狭窄，降低溃疡处黏膜收缩率。但该实验因设立自身对照，而无法观察体重、进食量、呕吐等指标。上述方法的安全性和有效性有待进一步评估，且暂时无相关临床应用的报道。

3.3 细胞组织移植 异体组织、细胞通过体外培养或自体组织直接移植可在除去其免疫原性的同时，保持其生物学结构和特性，从而被用于创面的修复和再生。早在2006年Ohki等[23]首先尝试提取犬OMEC体外培养后制成OMEC膜片，在ESD术后直接将其自体移植于术后创面，发现移植组中性粒细胞浸润程度显著低于对照组(2/0.01 mm2比24/0.01 mm2，P<0.05)，移植部位有完整、成熟的上皮形成，与天然食管黏膜上皮非常相似，创面黏膜修复明显优于对照组。后续的研究中，研究者将猪空肠黏膜下层去细胞化处理后用于食管黏膜结构重塑，并将其与犬自体OMEC结合后移植至食管创面，发现OMEC不仅能减轻食管狭窄和促进体重增加，还能减轻黏膜炎症反应，促进再上皮化和黏膜肌层再生[24]。在ESD切除超过1/2食管周径的患者中，OMEC膜片使得黏膜缺损上皮修复的中位时间为3周，术后食管狭窄发生率为10%；物流系统和设备的成功设计，能快速地从诊所收集材料并运送到偏远的细胞处理中心，再将培养的OMEC送回内镜中心进行移植手术[25-26]。

皮瓣移植是整形外科的一项重要技术，皮瓣是由具有带蒂血液供应的皮肤及其附着的皮下组织所组成，自体组织构成的皮瓣几乎不会发生排斥反应，更容易存活。Tang等[27]对实验动物于ESD术后即刻进行自体皮瓣移植，发现在ESD术后第3周，与皮瓣植入组相比，对照组动物出现明显的进食困难及体重减轻。内镜检查发现，皮瓣植入组动物食管狭窄较轻，内镜通过ESD术后瘢痕处仅有轻微阻力；而在对照组食管狭窄很严重，内镜不能通过。临床研究[28-30]结果表明自体动脉皮瓣移植已成功用于食管重建，也为ESD术后食管重建奠定了研究基础。

4 总结与展望

目前，ESD已被广泛应用于早期食管癌及癌前病变，但其术后食管狭窄发生率高，解决狭窄的现有技术手段疗效不尽如人意，进一步探究新的技术、材料及方法具有重要临床意义。目前研究者们已成功开展组织细胞工程技术，将自体细胞及组织进行体外培养及重建，通过皮下注射、口服、膜片固定等方式应用于手术创面，还有研究利用新型材料支架、自体皮瓣移植等方法防治术后狭窄，这些措施均在动物ESD术后模型中获得良好的效果。目前已有部分研究成果应用于临床，但因合成工艺复杂、样本储存困难、运输难度较大，尚无法大规模推广使用。尽管上述技术、材料及方法前景较好，但大多仅在小规模的动物实验中进行了测试，仅研究了短期影响，且缺乏与现有技术手段的疗效的对比研究，因此还有待更大样本量的研究评估长期疗效，以及大规模多中心的前瞻性临床研究提供更可靠的证据。