超高效液相色谱-三重四级杆质谱多反应监测模式测定葡萄酒中41种农药和7种真菌毒素残留

周春红，彭文静

1(甘肃省产品质量监督检验研究院，甘肃 兰州，730000)2(兰州市农业科技研究推广中心，甘肃 兰州，730000)

葡萄酒酒精度较低，口感醇厚愉悦，香气优雅和谐，含有多种营养成分，随着经济的快速增长，受到越来越多消费者的喜欢。

农药可以对真菌、虫草等有害生物进行防治，部分农药可以有效的控制植物生长，广泛应用于农业生产。规范合理的施用农药，可以使农产品高产、高质量，然而不合理的施用易导致食品中残留农药。少量农药在人体内残留不会立即产生危害，但是化学性质比较稳定的农药在人体内长时间蓄积会对人体造成伤害[1]。同时，农药通过影响葡萄酒中的酚类物质，影响酒的色泽、香气等[2]。为保证葡萄的质量和产量，葡萄在栽培过程中易使用防病虫害的农药，这些农药可残留在葡萄表皮并伴随着发酵过程转移到葡萄酒中[3-6]。因此，葡萄酒中的农药残留问题已引起生产者和消费者的广泛关注[7]。

QuEChERS法[8]可同时分析农残、真菌毒素等多种化合物，主要包括萃取、盐析、净化3部分。与传统前处理方法相比，具有快速、试剂耗材损耗少、可同时提取多种组分等优点，广泛用于复杂基质样品中的多种组分的同时提取、净化[9-10]。葡萄酒中农药残留和真菌毒素残留检测需要较高的灵敏度，目前蔬菜、水果等不同基质中农药残留和真菌毒素常用的方法有LC-MS/MS[11-14]、GC-MS[15]、GC[16]等。LC-MS/MS法可测定不易挥发或高温易分解的化合物，适用于分析复杂基质样品，具有高灵敏度、耗时短、同时检测多种组分等优点，可应用于葡萄酒中农残和真菌毒素污染分析。目前，针对葡萄酒中农药残留和真菌毒素的检测方法及限量还没有相关标准进行规范，关于利用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法检测葡萄酒中农药和真菌毒素残留也鲜见报道。因此，对葡萄酒中多种有毒有害物质残留量进行有效监控，建立一种简单、高效的高通量筛查方法是十分迫切的。

本文选择了52种较常见的农药和8种易污染的真菌毒素作为研究对象，以葡萄酒为研究基质，运用QuEChERS结合超高效液相色谱-质谱/质谱联用法(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-MS/MS)建立快速测定葡萄酒中多种农药残留和真菌毒素残留的检测方法，提高检测效率，以期为建立系统的检测分析葡萄酒中多种农药残留和真菌毒素残留相关标准提供数据支持，为葡萄酒安全和提高葡萄酒产品品质提供科学依据，为市场监管葡萄酒品质的风险评估提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄酒样品购于超市。

标准物质：60种待测物质标准品信息详见附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)，天津阿尔塔公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯)，德国Meker公司；乙酸铵、甲酸(色谱纯)，天津科密欧化学试剂有限公司；QuEChERs盐包、净化粉，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

QTRAP 4500 UPLC-MS/MS，美国SCIEX公司；VXR涡旋振荡器，德国IKA公司；KH30R-Ⅱ高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；KQ-600DE超声波清洗器，东莞市科桥超声波设备有限公司；十万分之一天平(精密度为0.01 mg)，Sartorius公司；Milli-Q Gradient纯水仪，美国Millipore公司；TLE204E分析天平(精密度为0.000 1 g)，梅特勒公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

Waters Acquity UPLC T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量 5 μL；流动相：A为乙腈水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)，B为乙腈；流动相梯度洗脱程序：0～3.0 min，5%～30% B；3.0～4.0 min，30%～40% B；4.0～6.0 min，40%～95% B；6.0～8.0 min，95% B；8.0～8.2 min，95%～5% B；8.2～12 min，5% B。

1.3.2 质谱条件

电喷雾电离源：ESI；检测方式：MRM模式；气帘气0.24 MPa；碰撞气：medium；离子化电压5 500 V；离子源温度550 ℃；喷雾气0.38 MPa；辅助加热器0.41 MPa。60种目标化合物在MRM模式下的质谱条件具体见附表1。

1.3.3 标准溶液的配制

农残混合标准储备液的配制(10 μg/mL)：分别准确称取各对照品10 mg于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成母液(附表1)。分别移取母液各100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成质量浓度为10 μg/mL的混合标准储备液，于-18 ℃下密封保存。

真菌毒素混合标准储备液的配制(1 μg/mL)：分别准确移取4种黄曲霉毒素混合标准溶液(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2)500 μL、玉米赤霉烯酮标准溶液100 μL、脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液50 μL、赭曲霉毒素A标准溶液50 μL于5 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 μg/mL的混合标准工作溶液，于-18 ℃下密封保存。

溶剂标准工作液：准确移取适量的农残混合标准储备液和真菌毒素混合标准储备液，用20%(体积分数)乙腈水溶液配制成系列标准溶液，现用现配。

空白葡萄酒基质溶液：称取阴性葡萄酒样品经1.3.4提取、净化处理后于4 ℃下条件下贮存备用。

基质标准工作液：准确移取适量的农残混合标准储备液和真菌毒素混合标准储备液，用空白葡萄酒基质溶液配制成系列标准溶液，现用现配。

1.3.4 样品前处理

准确称取10 g(精确到0.1 mg)葡萄酒样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混匀1 min，加入QuEChERs盐包(4 g MgSO4，1 g NaC1，0.5 g柠檬酸氢二钠,1 g柠檬酸钠)，加入1颗陶瓷均质子，剧烈振荡1 min 后4 000 r/min离心5 min；移取7 mL上清液至净化管中(150 mg MgSO4, 50 mg C18, 50 mg乙二胺-N-丙基硅烷)，涡旋混匀1 min，4 000 r/min离心5 min，吸取上清液过0.22 μm滤膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.5 方法学考察

1.3.5.1 基质效应、线性关系、相关系数及检出限

1.3.3中配制好的溶剂标准工作液、基质标准工作液按照1.3.1 和1.3.2色谱及质谱条件直接进样测定，以对照品浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)做标准曲线，得到48种待测物质的线性方程、相关系数，通过基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率之比来考察48种待测物质的基质效应。采用阴性葡萄酒样品加标方式考察48种待测物质的检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。

1.3.5.2 精密度和加标回收试验

在阴性葡萄酒样品中添加25、50、80 μg/kg 3个水平的混合标准溶液，每个加标水平做6次平行实验，采用优化后的实验条件进行测定，计算低、中、高3个添加水平的加标回收率和相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

2 结果与分析

2.1 MRM模式下农药残留和真菌毒素残留检测方法的建立

2.1.1 质谱条件的优化

运用质谱进行分析时，化合物的母离子、子离子、去簇电压、碰撞能量需要优化。本研究在国家标准及文献报道[7-14]的基础上，采用Scan模式扫描确定母离子、子离子，在MRM模式下找出48种目标化合物的特征子离子碎片，并优化DP和碰撞能量使各离子碎片的响应值达到最优，优化后的质谱条件如附表1所示。

2.1.2 色谱条件的优化

不同类型药物的极性差异较大，流动相的组成不仅影响目标化合物的峰形，还影响目标化合物的离子化效应。本研究考察了乙腈+水、0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)4种流动相体系的分离效果。结果显示0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)作为流动相时各化合物的峰型较好，60种待测物质的MRM总离子流图如附图1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)所示，因此选择0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)为流动相进行后续试验。

2.2 方法学考察

2.2.1 基质效应

基质效应(matrix effects，ME)是指葡萄酒中脂肪酸、糖、醇等在质谱离子化的过程中增强或减弱待测物质的响应[15]。若ME<1时，表示存在基质抑制效应；ME=1时，表示不存在基质抑制效应；ME>1时，表示存在基质增强效应。结果表明，10%药物的ME<0.8%，呈现为基质抑制作用；47.5%药物的ME为0.8%～1.2%，基质效应相对不明显；42.5%药物的ME>1.2%，呈现为基质增强作用。因此，本实验采用空白葡萄酒基质配制标准曲线，降低待测物质的基质效应影响。

2.2.2 线性关系、相关系数及检出限

由附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ & dbname=CAPJLAST & filename=SPFX2022061400D)可知，41种农药和7种真菌毒素在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数(r)≥0.999 01。采用阴性葡萄酒样品加标方式考察48种待测药物的检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，检出限为0.01～5 μg/kg，定量限为0.05～17 μg/kg。

2.2.3 回收率和精密度

在阴性葡萄酒样品中添加低、中、高3个水平的混合标准溶液，每个加标水平测定6次，加标回收率及精密度结果如附表3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)所示。其中48种待测物质的加标回收率为79.6%～122.5%，RSD为0.21%～6.39%。

2.2.4 实际样品的测定

采用建立的方法测定了15批次市售葡萄酒样品中41种农药和7种真菌毒素残留，其中15批次样品均未检出真菌毒素残留，2批次样品中未检出农药残留，其他13批次样品单批样本中检出药物种类2～6种，共检出药物9种(表1)，分别为烯酰吗啉、多菌灵、噻虫嗪、戊唑醇、嘧菌酯、霜霉威、甲霜灵、腈菌唑、甲萘威。所有样品中检出烯酰吗啉的含量为1.0～57.1 μg/kg，多菌灵的含量为10.6～62.4 μg/kg、噻虫嗪的含量为0.5～2.1 μg/kg、戊唑醇的含量为4.6～39.4 μg/kg、嘧菌酯的含量为2.2～3.7 μg/kg、霜霉威的含量为0.3～37.8 μg/kg、甲霜灵的含量为0.9～32.7 μg/kg、腈菌唑的含量为1.4～6.8 μg/kg，样品中均未检出克百威。其中多菌灵、甲霜灵及克百威结果符合NY/T 274—2014的标准要求。

表1 葡萄酒样品中药物的含量 单位：μg/kg

在检测的15批次样品中，烯酰吗啉、甲霜灵、多菌灵、霜霉威检出率较高。相关研究表明，葡萄种植过程中霜霉病在葡萄生长后期易发病且周期较长，烯酰吗啉、霜霉威可较好的抑制霜霉病菌的孢子囊萌发，可以有效防治葡萄的霜霉病[16-17]；甲霜灵、多菌灵、嘧菌酯等易检出农药可有效防治轴枯病、灰霉病、炭疽病等常见的病虫害[18-20]。由此可知，葡萄的种植过程中农药使用情况普遍存在且检出率较高，建议在葡萄的种植过程中规范栽培管理，重视农药的剂量使用。

3 结论

本文利用液相色谱-三重四级杆串联质谱MRM模式，建立了葡萄酒中41种农药残留和7种真菌毒素残留的高通量检测方法。48种待测物质中线性良好，检出限为0.01～5 μg/kg，定量限为0.05～17 μg/kg，加标回收率为79.6%～122.5%，RSD为0.21%～6.39%。该方法操作简便、快速简单，可同时分析葡萄酒中48种化合物，满足葡萄酒中农药和真菌毒素残留的快速筛查和定量检测，为今后制定相关检测标准提供方法依据。