不同抗氧化剂对皮肤抗氧化效果的对比研究

吴昱萱，刘昌树，刘建国，李可欣，刘大松*，周鹏

1(食品科学与技术国家重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)2(佳格食品(中国)有限公司，江苏 苏州，215000)

紫外线是导致皮肤老化的重要外源性因素，其中对人体皮肤造成损害的主要是UVA(320～400 nm)和UVB(290～320 nm)波段[1]。UVA和UVB诱导机体过度产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)是导致皮肤损伤的重要原因，ROS积累使得内源性抗氧化系统受损，机体趋于氧化应激状态，进一步刺激基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)上调， MMPs能降解大部分的细胞外基质，如胶原蛋白、弹性蛋白[2]。另一方面，ROS在促炎信号级联反应中充当第二信使，在机体处于氧化应激状态时，可刺激产生促炎细胞因子，加剧炎症反应[3-4]。机体最终表现出泛红、干燥、缺乏弹性、皱纹加深等一系列皮肤损伤，严重影响人们的外表自信。随着审美水平的不断提高，预防和延缓紫外线导致的皮肤老化显得十分必要。

氧化应激能引发皮肤基质的降解和炎症因子的激增，最终导致皮肤老化。核因子红细胞系-2相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2/ antioxidant response element，Nrf2/ARE) 信号通路是调节氧化还原平衡的重要途径，可控制下游多种抗氧化酶的表达，从而清除ROS，中和过氧化产物，维持氧化还原稳态，在保护皮肤免受紫外线诱导的氧化损伤方面发挥着重要的作用，因而以Nrf2/ARE信号通路为作用靶点的天然抗氧化剂是抗皮肤光老化的潜在原料[5-6]。

因此，本研究以石榴提取物、雨生红球藻提取物、针叶樱桃提取物、维生素E这4种常用的天然抗氧化剂为原料，以UVA+UVB紫外线造模的裸鼠为研究对象，比较不同抗氧化剂灌胃处理对皮肤抗氧化效果的影响，以期为具有皮肤改善效果产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红石榴浓缩粉(安石榴甙：33.2%，鞣花酸：1.1%)，西班牙Euromed公司；雨生红球藻虾青素微囊粉(虾青素：2.4%)，大连医诺生物股份有限公司；针叶樱桃浓缩粉(维生素C：18%)，浙江天草生物制品有限公司；天然维生素E粉(混合生育酚浓缩物：30.96%)，陕西海斯夫生物工程有限公司；BALB/c Nude裸鼠(SPF级、7周龄、雄性)，维通利华实验动物有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒，南京建成生物研究所；ROS试剂盒，上海贝博生物科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、蛋白质羰基(protein carbonyl，PC)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、基质金属蛋白酶-1、9、12(matrix metalloproteinase-1、9、12，MMP-1、9、12)Elisa试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；总蛋白试剂盒，美国Thermo Scientific公司；组织总RNA提取、反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、SYBR qPCR Master Mix试剂盒，南京诺唯赞生物科技有限公司；其他实验试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UVA紫外灯管(波长320～400 nm，峰值波长340 nm)、UVB紫外灯管(波长290～320 nm，峰值波长313 nm)，荷兰皇家飞利浦公司；UV-313/UV-340双通道紫外辐照计，北京师大光电技术有限公司；皮肤弹性测试仪，德国Courage+Khazaka Electronic GmbH(CK)公司产品；CR-700 d色彩色差计，柯尼卡美能达(中国)投资有限公司；Nanodrop One/OneC型分光光度计、Multiskan Sky型酶标仪，美国Thermo Scientific公司；ETC811型PCR扩增仪，北京东胜生物科技有限公司产品；LightCycler96实时荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物实验分组及处理

1.3.1.1 动物分组

适应性喂养1～2周后， 60只BALB/c Nude裸鼠随机分为6组(n=10)：(1)空白组，灌胃等体积生理盐水；(2)模型组，灌胃等体积生理盐水；(3)石榴组，灌胃292 mg/kg bw红石榴浓缩粉(即安石榴甙和鞣花酸为100 mg/kg bw)；(4)雨生红球藻组，灌胃103 mg/kg bw雨生红球藻虾青素微囊粉(即虾青素为2.5 mg/kg bw)；(5)针叶樱桃组，灌胃556 mg/kg bw针叶樱桃浓缩粉(即维生素C为100 mg/kg bw)；(6)针叶樱桃+维生素E组，灌胃556 mg/kg bw针叶樱桃浓缩粉和2.66 mg/kg bw天然维生素E粉(即维生素C为100 mg/kg bw，混合生育酚为0.82 mg/kg bw)。灌胃体积为10 mL/kg，灌胃样品用生理盐水现配现用。除正常组，其余均进行UV暴露处理，在饲养期间记录小鼠体重变化与健康状态。

1.3.1.2 光老化模型建立

根据文献与预实验确定[19]：两支 UVA灯管和一支UVB灯管营造紫外线环境。紫外灯开启稳定30 min后利用紫外辐照计测定紫外线辐照强度。将小鼠放入5 cm×9 cm×4 cm的透明小盒子中，盒子顶部用1 cm×1 cm铁丝网固定小鼠，灯距离小鼠背部距离为30 cm。每周照射3次，连续2周，每次辐照剂量为5 600 mJ/cm2，UVA、UVB辐照强度分别1.44、0.14 mW/cm2。本次动物实验伦理经江南大学动物伦理委员会认可，审核编号为JN.No20210630b0800812[236]。

1.3.1.3 样品采集

实验结束后，禁食不禁水12 h，异氟烷麻醉，摘眼球取血，3 500 r/min，4 ℃离心15 min，取上层血清保存于-80 ℃。取背部皮肤约0.1 g加入0.9 mL预冷的生理盐水，利用快速研磨仪制成10%组织匀浆，3 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液保存于-80 ℃。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 小鼠脾脏指数测定

取脾脏用滤纸擦干称重，根据公式(1)计算脾脏指数：

(1)

1.3.2.2 血清、皮肤氧化应激和抗氧化酶指标测定

血清、皮肤组织上清液ROS、MDA、PC、SOD、GHS-Px、CAT根据试剂盒说明书进行测定。

1.3.2.3 皮肤Nrf2/ARE信号通路相关基因RT-PCR测定

根据试剂盒提取皮肤总RNA，测定浓度和纯度，对OD260nm/OD280nm=1.8～2.0的样品调整到相同浓度后逆转录为cDNA，采用RT-PCR扩增测定Nrf2、血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatequinone oxidoreductase1，NQO1)的相对表达。引物信息如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.2.4 皮肤胶原降解指标测定

皮肤组织上清液MMP-1、9、12根据试剂盒说明书进行测定。

1.3.2.5 血清炎症因子测定

血清IL-6、TNF-α根据试剂盒说明书进行测定。

1.3.2.6 皮肤表观指标测定

分别利用色差计和皮肤弹性测试仪测定小鼠同一部位背部皮肤的a*、总弹性、净弹性。取约0.1 g背部皮肤根据GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定皮肤水分。

1.4 数据处理

利用SPSS 26.0软件，运用LSD和Tukey进行组间方差分析，结果均以“平均值±标准差”来表示，P<0.05表示组间具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同抗氧化剂对小鼠生长指数的影响

由图1可知，体重整体呈上升趋势，其中石榴组体重下降，但该组饲养和解剖中也未发现其明显异常，其体重下降原因可能与石榴提取物及其代谢产物具有降脂效果有关[20]。各组脾脏指数无显著性差异(P>0.05)。

a-体重；b-脾脏指数

2.2 不同抗氧化剂对小鼠氧化还原稳态的影响

2.2.1 不同抗氧化剂对小鼠氧化应激程度的影响

紫外线照射诱导机体产生过量的ROS攻击细胞膜，生物大分子被破坏，大量的脂质、蛋白质过氧化氧化产物积累，如MDA和蛋白质羰基，由此加快皮肤结构损伤[21]。如图2所示，较空白组，紫外线照射导致模型组ROS、PC含量显著增加，石榴显著减少PC含量，针叶樱桃显著减少MDA含量，雨生红球藻显著减少ROS和PC含量，而针叶樱桃+维生素E能显著减少三者的含量(P<0.05)。说明石榴、雨生红球藻、针叶樱桃、针叶樱桃+维生素E干预能够降低紫外线照射导致的氧化损伤，其中针叶樱桃+维生素E的效果较好，雨生红球藻次之。前人研究已表明，摄入虾青素[10]、维生素C[13]、维生素E[22]可降低体内氧化应激程度，进而保护皮肤免受损伤，但仅对单一抗氧化剂进行研究，未进行多种抗氧化剂之间的体内对比。

a-血清活性氧荧光强度；b-皮肤MDA含量；c-皮肤蛋白质羰基含量

2.2.2 不同抗氧化剂对小鼠皮肤抗氧化酶的影响

内源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)能够抵消机体产生的ROS，维持氧化还原平衡，当紫外线照射产生ROS超出内源性抗氧化防御系统的调节能力时，动态平衡被打破，进而导致皮肤细胞氧化损伤，加剧皮肤光老化[3]。由图3所示，较空白组，模型组GSH-Px、CAT显著下调(P<0.05)，说明紫外线照射消耗机体内源性抗氧化酶；较模型组，雨生红球藻显著提高GSH-Px表达量，针叶樱桃+维生素E可显著提高GSH-Px、CAT表达量(P<0.05)，这与上述氧化应激的结果相对应。雨生红球藻是天然虾青素的理想来源，虾青素由于其“极性-非极性-极性”的结构特性，使其可以跨膜穿插在脂质双分子层中，兼具亲水区和疏水区捕获自由基的能力，使得少量的虾青素即可达到较高剂量普通抗氧化剂的效果[23]。针叶樱桃提取物富含维生素C，与维生素E在皮肤抗氧化方面是相互依赖的关系，维生素C是水溶性，存在于细胞质，维生素E为脂溶性，存在于细胞膜，紫外线照射产生的自由基攻击细胞膜，诱导过氧化连锁反应的发生，同时维生素E作为抗氧化剂转变为维生素E自由基，后者被维生素C还原为维生素E，二者的协同再生作用可能是其效果优于其他干预组的原因[14]。FUCHS等[15]也证实，维生素C和维生素E协同作用优于单独作用。提示亲水和亲脂互补可增强氧化应激的改善效果。

a-皮肤超氧化物歧化酶表达量；b-皮肤谷胱甘肽过氧化物酶表达量；c-皮肤过氧化氢酶表达量

2.2.3 不同抗氧化剂对小鼠皮肤Nrf2/ARE信号通路的影响

Nrf2/ARE是维持氧化还原平衡的重要调控通路，在外界刺激下， Nrf2移位进入细胞核，并结合抗氧化反应元件ARE，转录激活下游抗氧化酶，如NQO1、HO-1[24]。由图4所示，较空白组，模型组NQO1相对表达量显著下调，较模型组，针叶樱桃+维生素E、石榴分别显著上调Nrf2、HO-1相对表达量(P<0.05)。上述结果说明各抗氧化剂可通过调节氧化还原通路中相关因子表达，来提高皮肤抗氧化效果和抑制氧化损伤，与LOHAKUL等[25]研究结果相似。

a-皮肤Nrf2的mRNA相对表达量；b-皮肤HO-1的mRNA相对表达量；c-皮肤NQO1的mRNA相对表达量

2.3 不同抗氧化剂对小鼠皮肤胶原降解代谢的影响

真皮中最为丰富的成分是胶原蛋白，胶原蛋白的类型以Ⅰ和Ⅲ型为主，胶原蛋白交织成胶原纤维平行于皮肤表面，赋予皮肤抗拉强度；微纤维成分包埋在弹性蛋白中形成弹性纤维，维持皮肤弹性[1]。当机体处于氧化应激状态时会激活一系列信号转导途径，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，诱导下游MMPs表达，将胶原、弹性蛋白大分子降解为片段化，失去抗拉和弹性结构[2]。其中MMP-1、9是降解Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的主要活性蛋白[2]；MMP-12除了能够降解弹性蛋白，还能够激活其他MMPs家族成员，加速细胞外基质降解的级联反应[1]。如图5所示，较空白组，模型组MMP-1、9、12均显著增加，较模型组，石榴、雨生红球藻、针叶樱桃、针叶樱桃+维生素E可显著减少MMP-1、9或12(P<0.05)，说明各抗氧化剂均可抑制MMPs表达，维持胶原蛋白和弹性蛋白稳定性，延缓皮肤老化，其中针叶樱桃+维生素E效果较好，这可能得益于其良好的抗氧化效果。不仅如此维生素C作为脯氨酸羟化酶、赖氨酰羟化酶的辅助因子，还能够促进胶原蛋白合成，这已得到JEONG等[26]的证实。

a-皮肤基质金属蛋白酶-1表达量；b-皮肤基质金属蛋白酶-9表达量；c-皮肤基质金属蛋白酶-12表达量

2.4 不同抗氧化剂对小鼠机体炎症的影响

ROS积累促使核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)活化，介导下游促炎细胞因子分泌，进而刺激炎症反应，导致皮肤泛红，另外炎症不仅会加剧ROS生成，而且又会促进MMPs表达，加重皮肤损伤[4]。由图6所示，较空白组，模型组IL-6、TNF-α含量显著增加，雨生红球藻显著减少IL-6和TNF-α含量，针叶樱桃+维生素E干预可显著减少IL-6含量(P<0.05)，说明雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E可抑制促炎因子表达，改善皮肤炎症。该结果与上述雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E提高皮肤氧化还原稳态以及抑制胶原降解的结果相一致。MELO等[4]也表明摄入含有酚类抗氧化成分的马鞭草提取物可通过调节抗氧化-炎症-胶原代谢三者关系，改善紫外照射导致的皮肤损伤。

a-IL-6含量；b-TNF-α含量

2.5 不同抗氧化剂对小鼠皮肤表型的影响

色差a*值代表红绿值(红色>0，绿色<0)，用以表征紫外照射导致的皮肤色差变化，过度暴露于紫外会导致皮肤泛红，是皮肤炎症的外在表现。由图7可知，较空白组，模型组a*值显著升高，较模型组，石榴、雨生红球藻、针叶樱桃、针叶樱桃+维生素E显著下调a*值(P<0.05)，直观地反映了各抗氧化剂具有一定的皮肤炎症改善效果。这与STAHL等[17]研究结果相似，即摄入抗氧化剂后可改善紫外照射导致的皮肤泛红。除此之外，干燥、松弛也是常见的皮肤光老化问题，表现为水分流失以及弹性下降，石榴干预使得水分显著增加(P<0.05)，但皮肤弹性未见显著性改善，可能是由于干预时间过短而未能体现在皮肤表型上。

a-皮肤色差a*值；b-皮肤水分含量；c-皮肤总弹性；d-皮肤净弹性

3 结论

本研究利用UVA+UVB联合紫外照射建立小鼠皮肤光老化模型，准确真实地比较常见抗氧化剂对皮肤的改善效果。结果显示，口服摄入抗氧化剂不仅具有上调抗氧化酶表达，减少氧化产物积累，平衡皮肤氧化还原调节的作用，其中雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E效果较好。而且雨生红球藻和针叶樱桃+维生素E在抑制胶原、弹性蛋白降解相关酶和促炎因子的分泌上也表现出最优性，并使皮肤泛红程度下降。上述结果可为今后开发护肤产品提供原料选择，提升产品抗皮肤光老化效果，提高市场竞争力。

本文主要采用了单一天然抗氧化剂及其组合，进行皮肤抗氧化效果的对比研究，在后续的研究中，可考虑复配其他皮肤功效成分，如活性多肽，探究在维持皮肤健康方面是否有协同功效。此外，各抗氧化剂经体内消化吸收后的产物及其护肤作用机理，还可进一步研究。