不同发酵剂对兔肉脯食用品质的影响

柴利，贺稚非,2，廖林，谢兆华，韩薇，李洪军,2*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆，400715)

兔肉富含多不饱和脂肪酸、蛋白质和必需氨基酸，且脂肪、胆固醇和过敏源含量较少[1]，现已逐渐成为国民饮食结构中的理想肉食。近年来，受非洲猪瘟以及新冠疫情的影响，国内外兔肉产业的发展受到了一定的影响，但并没有改变兔肉产量稳步上升的趋势[2]。目前，国内外市场上的兔肉主要以冷鲜肉为主，兔肉产品也主要是麻辣兔头、冷吃兔和手撕兔等传统烹饪产品，并且现有的兔肉加工产品普遍存在易受微生物污染、保质期短、需要冷藏保存、质量参差不齐和深加工程度低等问题，这极大的阻碍了兔肉产业的进一步发展。

肉脯是一种味道鲜美、芳香浓郁、食用方便、耐贮藏、便于运输的休闲干肉制品。目前，市面上的肉脯主要是以传统工艺生产的猪肉脯和牛肉脯为主，普遍存在风味单一、质地干硬和颜色差等问题[3]，难以满足消费者的需求。在传统的肉脯制作工艺中引入微生物发酵技术，既能为肉脯带来特殊的风味、改善肉脯干硬、不易咀嚼等缺点，还能进一步延长肉脯的贮藏期[4]。例如，樊明明[5]用植物乳杆菌、肉葡萄球菌和戊糖片球菌对猪肉脯进行发酵，发现发酵猪肉脯在口感滋味、风味、色泽和硬度上均得到改善。高静等[6]用植物乳杆菌和酿酒酵母为复合发酵剂发酵猪肉脯，发现发酵可显著提升猪肉脯的风味。ZHAO等[7]用保加利乳杆菌生产发酵猪肉脯也得到了类似的结果。彭健斌[3]用植物乳杆菌、肉葡萄球菌和戊糖片球菌混合发酵剂制得的羊肉脯在感官、色泽、质构特性、挥发性风味物质种类、羊肉脯膻味物质的降解和货架期等方面均优于对照组。然而，关于发酵兔肉脯的研究还较少，主要集中于发酵剂对兔肉脯的游离氨基酸含量[8]和游离脂肪酸含量[9]的影响。

常用于肉制品发酵的菌株有乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母和霉菌[6]，本实验中采用的发酵剂分别为LHP DRY(戊糖片球菌、乳酸片球菌)、B-LC-78(乳酸片球菌、肉葡萄球菌)、CS-300(肉葡萄球菌、肉葡萄球菌亚种)和EasyCure LC(汉斯德巴氏酵母菌、弯曲酵母菌、肉葡萄球菌和小牛葡萄球菌)型商业发酵剂。乳酸菌在发酵肉制品中能改善风味、促进消化吸收和抑制杂菌生长繁殖[10]。葡萄球菌和微球菌能促进发酵肉制品中特殊发酵风味的形成[11]并抑制产品褪色和异味生成[12]，但是其产酸性能较弱，实际生产中常与乳酸菌混合使用。酵母菌主要生长在产品表面或浅表层，通常与其他菌种混合使用，具有稳定产品色泽，增强香味的作用[13]。因此，本文以雄性伊拉兔为原料，经斩拌、腌制、发酵、抹片、烘干、熟化和压片等工艺制成发酵兔肉脯，并在发酵阶段分别接种LHP DRY、B-LC-78、CS-300和EasyCure LC型商业发酵剂，通过对产品进行感官评定和一系列理化指标的测定，筛选出一种最适合用于发酵兔肉脯的商业发酵剂，以期为发酵兔肉脯的生产提供理论依据，同时为拓宽兔肉深加工产品领域和助力兔肉产业绿色发展作出一定贡献。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从重庆阿兴记良种选育基地挑选70～75日龄雄性伊拉兔(1.5～1.7 kg)，按照国家畜禽屠宰加工卫生规范宰杀兔子，去除皮、头、内脏和骨后立即放入装有冰袋的冷藏箱(6 ℃左右)运送到实验室，再将兔肉于4 ℃排酸处理24 h，于-18 ℃冻藏备用。

发酵剂(LHP DRY、B-LC-78、CS-300、EasyCure LC)，科汉森股份有限公司；白砂糖、食盐、鸡蛋、味精、十三香、姜葱料酒、鱼露，重庆永辉超市；乙基麦芽酚、复合磷酸盐、红曲红、D-异抗坏血酸钠、瓜尔豆胶、大豆分离蛋白，河南万邦化工科技有限公司；氯化钾、25%(体积分数)戊二醛、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、氯化钠、高氯酸、氢氧化钠，重庆跃翔化工有限公司。

1.2 仪器与设备

FA214A型电子分析天平，上海豪晟科学仪器有限公司；PB-10型酸度计，赛多利斯科学仪器有限公司；Ultra-Scan PRO型测色仪，美国Hunter Lab公司；Avanti J-301型冷冻离心机，美国贝克曼库尔特公司；TA.Plus型质构仪，英国stable micro system公司；SCIENTZ-12 N型真空冷冻干燥机、XHF-D型均质机，新芝生物科技股份有限公司；Phenom Pro型扫描电镜，Phenom World；L-8900型全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；cNose型电子鼻，上海保圣实业发展有限公司；RXZ-800B型人工气候箱，宁波东南仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

1.3.1.1 工艺流程

兔肉脯制备工艺流程如下：

原料肉处理→斩拌、腌制→发酵→抹片→烘干→熟化、压片、切片→冷却→包装

1.3.1.2 操作要点

原料肉处理：实验前12 h将兔肉取出放于4 ℃人工气候箱解冻，解冻后除去肉眼可见的筋膜和淤血等，切成小块。

斩拌、腌制：依照兔肉质量加入白砂糖11%，食盐1%，全蛋液5%，味精0.25%，乙基麦芽酚0.3%，复合磷酸盐0.3%，十三香0.2%，红曲红0.04%，D-异抗坏血酸钠0.05%，姜葱料酒1%，鱼露6%，瓜尔豆胶0.3%，大豆分离蛋白3%，葡萄糖2%，混合均匀后再用斩拌机斩拌4 min，于4 ℃腌制2 h。

发酵：按发酵剂添加量加入发酵剂，25 ℃恒温恒湿培养箱中发酵24 h。

抹片：先在洗净烘干的瓷盘表面刷一层植物油，再将肉糜抹到瓷盘上，用抹刀打平整，厚度为2～3 mm。

烘干：将烘箱预热至65 ℃，再将抹片的瓷盘放入，控温在65 ℃烘5 h，烘干期间每隔30 min翻1次。

熟化、压片和切片：将烘干后的肉铺放入烘箱中于150 ℃熟化2 min，趁热压片，然后切成4 cm×6 cm的片状。待自然冷却后用PET/PE真空包装袋包装。

上述工艺参数及配方由前期单因素试验得出。

1.3.2 实验设计

实验分为5组，不添加发酵剂的为对照组(control check, CK)，添加不同发酵剂的为实验组，具体见表1。

表1 实验设计表

1.3.3 指标测定

1.3.3.1 水分含量的测定

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中的直接干燥法进行测定。

1.3.3.2 pH值的测定

参考刘悦[2]的方法，稍作修改。称取3 g剪碎的样品，加入30 mL 0.1 mol/L的KCl溶液，以4 700 r/min均质60 s，随后用pH计测定，待读数稳定后计数，每个样品测3次，取平均值。测定前对pH计进行校准，25 ℃，校准缓冲液pH 4.00、pH 6.88。

1.3.3.3 色差的测定

使用Ultra-San PRO测色仪测定兔肉脯的L*、a*和b*值，检测前依次用黑板、白板校正，每组测3次，取平均值。

1.3.3.4 剪切力的测定

参考李培红[14]的方法，稍作修改。使用质构仪测定兔肉脯的剪切力，测定前将兔肉脯制成2 cm×2 cm的正方形。测定相关参数：采用A/MORS探头，测前速度1 mm/s，测试速度2 mm/s，测后速度10 mm/s，剪切率90%，感应力10 g。平行测定3次，取平均值。

1.3.3.5 质构特性的测定

参考KARGOZARI等[15]的方法，稍作修改。将肉脯制成2 cm×2 cm的正方形，分别测定样品的硬度、弹性和咀嚼性，每组重复3次。参数设置：测前速度1 mm/s，测试速度1 mm/s，测后速度1 mm/s，探头上升高度25 mm，压缩比25%，触发力5 g，间隔时间5 s，选用P/36R探头。

1.3.3.6 微观结构的测定

参考王梦琦等[16]的方法，稍作修改。将肉脯剪成0.5 cm×0.5 cm，并在4 ℃下于含有15 mL 2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L, pH 7.2)中固定24 h。将固定后的样品用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次15 min；依次用30%、50%、70%、90%和100%(体积分数)乙醇溶液脱水，每次1 h；再将样品用真空冷冻干燥机干燥24 h，然后将干燥的样品进行喷金镀膜，并通过扫描电子显微镜观察微观结构。

1.3.3.7 游离氨基酸的测定

参考付娜等[17]的方法，稍作修改。精确称取剪碎的兔肉脯2.50 g，加入10 mL 3.5%(体积分数)高氯酸溶液，4 700 r/min均质60 s，均质后离心(10 000×g，10 min，4 ℃)，离心后取上清液；用适量高氯酸溶液洗涤沉淀物再次离心，合并两次上清液并用1%或5%(质量分数)氢氧化钠溶液调节pH值至2.0，用纯水定容至25 mL。取1.5 mL过0.22 μm滤膜后用全自动氨基酸分析仪检测。

滋味活度值(taste activity value，TAV)的计算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3.8 电子鼻的测定

参考王强等[18]的方法，稍作修改。精确称取剪碎的兔肉脯2.00 g置于25 mL顶空瓶中，于55 ℃水浴加热30 min，冷却至室温后进行测定。主要实验参数：清洗时间60 s，测试时间90 s，气体流速1 L/min。

实验所用的电子鼻由10个传感器组成，电子鼻的传感器对多种气味都有强烈的响应值，具体如表2所示。

表2 电子鼻传感器敏感物质

1.3.3.9 感官评价

参考GB/T 12315—2008《感官分析 方法学 排序法》进行感官评价。感官评定小组由8名食品专业的学生组成，并统一进行感官评价专业培训。小组成员对5组兔肉脯的组织状态、色泽、气味和口感滋味依照喜好程度按5～1进行排序，分值越高代表越喜欢。感官评定标准见表3。

表3 感官评分标准

1.4 数据统计分析

采用SPSS 23软件进行单因素方差分析和聚类分析，显著性分析采用Duncan检验法，实验结果表示为平均值±标准偏差，P<0.05表示具有显著性差异，使用Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同发酵剂对兔肉脯水分含量和pH值的影响

由图1可知，5组兔肉脯的水分含量均满足GB/T 31406—2015《肉脯》的要求(≤20 g/100g)，且除B组外，其他实验组的水分含量显著低于对照组(P<0.05)，其中D组的水分含量降低至14.41 g/100g。同时，由于发酵剂中的微生物发酵产酸，故实验组的兔肉脯pH值显著降低(P<0.05)。低pH环境不仅可以抑制病原菌和腐败菌的生长繁殖，还提高了产品的微生物安全性[7]。此外，pH值的降低也会导致蛋白质变性，肉的保水性下降[19]，从而使得兔肉脯的水分含量降低。

图1 不同发酵剂对兔肉脯水分含量和pH值的影响

2.2 不同发酵剂对兔肉脯色差的影响

由图2、图3可知，发酵剂的加入对兔肉脯的L*值和b*值影响不大，但实验组的a*值显著高于对照组(P<0.05)，5组兔肉脯按a*值从大到小排序依次为C组>D组>A组>B组>CK组，说明发酵剂的加入能够改善发酵兔肉脯的色泽，使其颜色更鲜艳。这可能是由于发酵剂中的微生物能够将高铁肌红蛋白转化为氧合肌红蛋白或亚硝基肌红蛋白，从而起到呈色效果[20]。

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图2 不同发酵剂对兔肉脯色差的影响

a-CK组；b-A组；c-B组；d-C组；e-D组

2.3 不同发酵剂对兔肉脯剪切力和质构特性的影响

嫩度通常是评价肉及肉制品的重要品质指标，剪切力越小，肉的嫩度越好。由图4可知，发酵剂的加入对兔肉脯的剪切力有显著的影响(P<0.05)，各组剪切力由大到小排序依次为CK组>D组>C组>A组>B组，其中B组的剪切力降至52.82 N，与对照组相比下降了66.9%，表明发酵兔肉脯的嫩度得到了改善。

图4 不同发酵剂对兔肉脯剪切力的影响

由表4可知，5组兔肉脯在弹性上没有显著差异(P>0.05)，但是A、B、C 3组兔肉脯的硬度和咀嚼性显著降低(P<0.05)，使肉脯更易咀嚼和吞咽。实验组的剪切力、硬度和咀嚼性显著降低可能是因为在发酵过程中肉葡萄球菌、小牛葡萄球菌和戊糖片球菌分泌的蛋白酶使兔肉的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白发生不同程度的降解，破坏了肌原纤维的结构[21]，从而使得兔肉脯的硬度、咀嚼性和剪切力变小。综上，发酵剂可以提高兔肉脯的嫩度，并且使兔肉脯的硬度和咀嚼性也降低，改善了传统肉脯干硬、不易咀嚼的缺点。

表4 不同发酵剂对兔肉脯质构特性的影响

2.4 不同发酵剂对兔肉脯微观结构的影响

由图5可知，对照组的兔肉脯肌纤维较光滑，加入发酵剂后对兔肉脯的肌肉结构破坏严重，肌原纤维的连接发生崩解，呈碎片化。这主要是因为发酵剂中的肉葡萄球菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌在发酵过程中能够在兔肉脯内部和表面生长，并且分泌分解脂肪和蛋白质的脂肪酶和蛋白酶，从而使兔肉脯呈现图5-b～图5-d所示的肌原纤维小片化和断裂的现象，这与彭健斌[3]在羊肉脯中添加肉葡萄球菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌进行发酵的研究结果类似。扫描电镜的结果也进一步表明了发酵剂能够改变兔肉的肌肉结构，从而使兔肉脯的剪切力和硬度降低。

a-CK组；b-A组；c-B组；d-C组；e-D组

2.5 不同发酵剂对兔肉脯游离氨基酸的影响

2.5.1 不同发酵剂对兔肉脯游离氨基酸组成的影响

兔肉中的蛋白质在发酵过程中产生的各种肽类和游离氨基酸是兔肉脯产生特色风味的前体物质。由表5可知，5种兔肉脯都含有14种游离氨基酸，6种人体所必需的氨基酸；根据总游离氨基的含量多少排序依次为B组>D组>A组>C组>CK组，其中B组显著高于其他4组(P<0.05)，这表明B组的乳酸片球菌和肉葡萄球菌对兔肉蛋白质的水解能力要强于其他组。从表5中还可以看出，各组谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量都非常丰富，表明这些氨基酸是兔肉脯中主要的呈味物质；此外，实验组兔肉脯中的丝氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和精氨酸的含量与未发酵的兔肉脯相比都有所增加。综上，微生物发酵剂可以提高兔肉脯中游离氨基酸的总量(P<0.05)，使兔肉脯的风味更加丰富。

表5 不同发酵剂对兔肉脯游离氨基酸的影响 单位：mg/100g

2.5.2 不同发酵剂对兔肉脯游离氨基酸味觉特征及TAV的影响

不同游离氨基酸的呈味阈值不同，故游离氨基酸的含量并不能用来评价对滋味的贡献度。一般用游离氨基酸的风味强度值(TAV)来评价游离氨基酸对滋味的贡献程度，当某种游离氨基酸的TAV>1时，则认为该物质对滋味有贡献，并且TAV越大，滋味贡献越高[22]。由表6可知，5组兔肉脯的总鲜味氨基酸最多，苦味氨基酸次之，甜味氨基酸最少；并且只有谷氨酸(鲜味)和丙氨酸(甜味)的TAV>1，其中谷氨酸的TAV达到14.61～16.32，丙氨酸的TAV达到1.02～1.20，是所有氨基酸中TAV最大的两种，说明兔肉脯的整体风味为鲜甜味，具体见图6。虽然各组都含有较多的苦味氨基酸，但LIOE等[23]研究发现，当苦味氨基酸的TAV<1时，对其他氨基酸的鲜味和甜味有增强作用。此外，实验组的鲜、甜和苦味TAV总和均大于对照组，其中B组总体的鲜味和甜味TAV最大，进一步表明发酵剂能够促进兔肉脯滋味物质的生成，尤其是B组的乳酸片球菌和肉葡糖球菌对促进发酵兔肉脯中呈味游离氨基酸的富集效果显著。

表6 不同发酵剂对兔肉脯游离氨基酸味觉特征及TAV

图6 不同发酵剂对兔肉脯呈味氨基酸总量组成模式分析

2.6 添加不同发酵剂对兔肉脯风味的影响

2.6.1 电子鼻分析

电子鼻是一种旨在模仿人类嗅觉感知的设备，它由一系列传感器组成，用于检测复杂的气味[24]，并已在区分食品风味方面得到验证[25]。由图7可知，W3C、W1W和W2S 3个传感器在各组均具有较高的响应值，表明氨、芳香类、无机硫化物、醇类、醛类和酮类是兔肉脯中的主要风味物质。对照组和实验组的兔肉脯起到区别作用的传感器有W1C、W5S、W6S、W5C、W1S，其中，对照组兔肉脯中的芳烃化合物和氮氧化合物响应值显著高于实验组(P<0.05)；添加发酵剂后，在氢化物、短链烷烃芳香成分和烷类的响应值增加(P>0.05)。综合来看，B组和D组的发酵兔肉脯综合响应值最高，风味物质最为丰富。

图7 不同兔肉脯的电子鼻传感器响应值雷达图

2.6.2 聚类分析

聚类分析是一种研究分类问题的多元分析方法，已广泛用于食品风味物质的评价[26]。本文采用组间连接法和欧氏距离，根据相似性对5组兔肉脯进行分类，结果用树状图表示(图8)。当欧式距离为10时，5个样品可分为3类。其中，对照组为一类，A组为一类，剩余B、C、D组为一类，说明添加发酵剂对兔肉脯的风味有较大的影响，并且B、C、D组的发酵兔肉脯在风味上具有相似性，这可能是因为这3组发酵剂中都含有肉葡萄球菌，具有相似的脂肪酶和蛋白酶，从而分解蛋白质和脂肪产生相似的风味物质。

图8 不同兔肉脯的聚类分析图

2.7 五组兔肉脯感官评定的结果

对5组样品进行排序检验，采用Friedman检验法计算样品间是否存在显著性差异，当品评员数j=8，样品数p=5时，Friedman检验临界值表见表7，并采用Kramer检验法进行排序。评价员感官评定结果如表8所示。

表7 Friedman检验临界值

在组织状态上，由表8可知j=8，p=5，R1=13.5，R2=16.5，R3=33.5，R4=30，R5=26.5，由Friedman检验公式：

表8 兔肉脯感官评定结果

式中：j为品评员人数；p为样品数；Ri为第i个产品的秩和。

带入得到Ftest=14.95>F0.01。同理，在色泽上，Ftest=9.8>F0.05；在气味上，Ftest=10.33>F0.05；在口感滋味上，Ftest=13.23>F0.01。综上，5组兔肉脯在组织状态和口感滋味上，有极显著差异(P<90.01)，在色泽和气味上，有显著差异(P<0.05)。

样品之间可以根据差异程度进行分组，查Kramer检验表，得到检验表(α=0.05，α=0.01)中对应品评员数j=8，样品数p=5的临界值如表9所示。通过下段检查样品间的差异程度，如果排序秩和在下段区间范围内可划分为一组，如果排序秩和下段范围的上限之外和下限之外的样品可分别组成一组[27]。据表9可知，在α=0.01的显著水平下，根据组织状态各样品可分为3组：CK，ADC，B，口感滋味可分为3组：D，CKAC，B，说明B组发酵剂中的乳酸片球菌和肉葡萄球菌能够明显的改善兔肉脯的组织状态和口感滋味。在α=0.05的显著水平下，根据色泽各样品可分为2组：CK，ABCD，说明实验组的微生物发酵剂都能较好的促进兔肉脯发色；根据气味可分为2组：CK，DCAB，说明感官评定员对实验组兔肉脯的气味喜爱度要优对照组。综合兔肉脯的组织状态、口感滋味、色泽和气味来看，B组发酵兔肉脯的综合得分最高，说明B组的发酵兔肉脯更易被消费者接受。

表9 j=8，p=5时Kramer检验表上下限

3 结论

本文研究了4种商业发酵剂对兔肉脯食用品质的影响。研究结果表明，与对照组相比，实验组发酵兔肉脯的水分含量为14.4%～15.5%，pH值为5.4～5.9，均低于对照组。从色差的测定结果可以看出，4种发酵剂对发酵兔肉脯都具有促进发色的作用。另外，发酵剂中的微生物可以破坏兔肉肌肉结构的完整性，从而使发酵兔肉脯的剪切力、硬度和咀嚼性均显著降低。综合来看，B组的发酵剂能够最有效地改善兔肉脯的质地。从游离氨基酸和电子鼻测得的风味物质可以看出，经微生物发酵后的兔肉脯风味和滋味都更加丰富。其中，B组发酵剂能较大程度的促进滋味和风味物质的富集。综合感官评分的结果可以看出，B组在组织状态、气味和口感滋味上都具有较高的喜爱度。因此，B组的肉葡萄球菌和乳酸片球菌可认为是4种商业发酵剂中制作发酵兔肉脯最佳的发酵剂，未来可进一步优化发酵工艺用于发酵兔肉脯的开发和生产。