基于网络药理学研究消渴平合剂治疗气阴两虚型糖尿病的作用机制*

陈 浪 王应旻

浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

糖尿病属于中医学“消渴”范畴，中医注重整体观念、辨证论治，中药多靶点、多途径的作用特点，对于糖尿病这类多因素致病的疾病有良好疗效。消渴平合剂是我院院内制剂，由黄芪、山药、生地、麦冬、天花粉、丹参、菊花、枸杞子组成，具有益气养阴、生津润燥之功效，临床应用疗效显著。但其作用的化学物质及具体机制仍不清楚。本研究通过网络药理学对消渴平合剂的主要活性成分进行分析，并对其治疗糖尿病的潜在作用靶点进行生物信息学分析，旨在为研究消渴平合剂治疗糖尿病的机制提供研究思路，以期为临床推广使用提供依据。

1 研究方法

1.1 消渴平合剂中入选活性成分的筛选和靶点预测：检索中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)[1]和中药综合数据库(TCMID)[2]中消渴平合剂各项化学成分及靶点，参考各成分的毒药物动力学(ADME)参数开展筛选工作。所设定的筛选条件如下：口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18[3，4]。利用Uni Prot疾病靶点标准化数据库校正与活性成分相关的靶点蛋白，蛋白种属设置为“homo sapiens（human）”，获得靶点对应的标准基因名。

1.2 疾病靶点的检索及获取：通过GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库，以“diabetes”为关键词，限制检索条件为“gene”与“homo sapiens”，获得与糖尿病相关的疾病靶点基因。将所有靶点基因进行合并，剔除重复靶点基因，即为所需的疾病总靶点。

1.3 治疗糖尿病潜在作用靶点的Venn分析：通过R语言获得药物靶点和疾病点的交集靶点，绘制韦恩图，即为消渴平合剂治疗糖尿病的潜在作用靶点。

1.4 绘制中药复方调控网络：利用网络可视化软件平台Cytoscape3.8[5]构建“有效活性分子-靶基因”复方调控图，其中图中“节点”表示有效成分、靶基因，“边”表示有效成分与靶基因之间的关系。

1.5 蛋白互作网络构建和CytoNCA网络拓扑分析：将Venn分析得到的交集靶点在线导入STRING数据库，限定物种为人，得到蛋白与蛋白间的相互作用信息，将获得的数据信息导入Cytoscape软件，生成PPI网络图。利用网络拓扑分析插件CytoNCA筛选出上述交集网络中自由度大于所有节点中心性（DC）、介度中心性（BC）、特征向量中心性（EC）、接近中心性（CC）即为关键基因。

1.6 GO和KEGG信号通路富集分析：使用R语言对上述关键靶点进行GO和KEGG富集分析；节点越大代表显著性越高，说明该通路的重要性越高。选择前20条绘制柱状图、气泡图。

2 结果

2.1 消渴平合剂活性成分和靶点筛选：通过TCMP及TCMID数据库检索，并通过OB和DL筛选，获得有报道的党参有效成分65个，枸杞子45个，黄芪20个，生地4个，菊花20个，麦冬1个，山药16个，天花粉2个，总计173个。相应的靶点3310个。

2.2 治疗糖尿病潜在作用靶点的Venn分析：检索数据库获取疾病靶点基因，GeneCards8758个、OMIM411个、PharmGkb314个，TTD37个，DrugBank50个，剔除重复后共计8960个，见图1a；通过R语言绘制疾病和药物交集基因共计228个，并绘制韦恩图（图1b），即为消渴平合剂治疗糖尿病的潜在作用靶点。

图1 韦恩图

2.3 绘制中药复方调控网络：通过Cytoscape3.8绘制调控网络。见图2。

图2 消渴平合剂活性成分-基因靶点调控网络图

图2中方块部分为药物和疾病基因的交集基因，圆圈为消渴平合剂中药物的活性成分。

2.4 PPI网络建立：将Venn分析得到的228个交集靶点在线导入STRING数据库，限定物种为人，得到蛋白间的相互作用信息，将STRING数据库中获得的数据导入Cytoscape软件，通过插件cytoNCA对网络进行拓扑分析。蛋白基因JUN，MYC，MAPK1，TP53等16个靶点即为消渴平合剂治疗糖尿病的潜在作用靶点。见图3。

图3 消渴平合剂治疗糖尿病的潜在作用靶点

2.5 GO和KEGG富集分析：通过R语言对228个基因进行GO和KEGG通路分析。GO分析基于细胞成分、生物过程和分子功能。通过分析确定了2966个GO项显示显著富集（FDR＜0.05）；其中2616个、118个、230个依次和生物过程、细胞成分、分子功能相关。选取前10个绘制柱状图，如图4所示。

图4 消渴平合剂治疗糖尿病靶基因GO富集分析图

通过KEGG通路分析来确定消渴平合剂在治疗糖尿病中显著影响的通路。我们确定了186个显著富集的通路(FDR＜0.05)，包括AGE-RAGE通路、凋亡、内分泌抵抗以及与IL-17等相关的通路。选取前30个绘制气泡图，如图5所示。

图5 消渴平合剂治疗糖尿病KEGG信号通路富集分析图

通过R语言pathview包绘制了消渴平合剂治疗糖尿病的通路图，如图6所示，途径靶点用白色标记，消渴平合剂治疗糖尿病的靶点用红色标记。通路图显示消渴平合剂参与了糖尿病的治疗，包括AGE-RAGE通路、PI3K/AKT信号通路和Jak-STAT信号通路，有效靶点有34个。提示消渴平合剂可能通过调控多个方面发挥治疗糖尿病的作用，其靶点可能定位于这些通路。

图6 消渴平合剂通过介导AGE-RAGE信号通路治疗糖尿病的示意图

3 讨论

消渴平合剂处方来源于我院省级名中医史奎钧主任中医师，根据消渴病气阴两虚、燥热津伤为主的病机特点，以丹溪消渴方为基本方加减而成，方药由黄芪、山药、生地、麦冬、天花粉、丹参、菊花、枸杞子组成，具有益气养阴、生津润燥之功效。既往研究[6,7]已表明消渴平合剂具有降糖、改善胰岛β细胞功能、降低炎症反应同时可减少尿蛋白，保护肾功能。本研究利用网络药理学方法探讨消渴平合剂治疗糖尿病的分子机制。利用173个有效化合物与228个疾病和药物交集靶点构建了消渴平合剂的化合物-靶点-疾病网络调控图，并进行PPI蛋白互作分析，结果表明，消渴平合剂的大部分化合物作用于多个靶点，其中槲皮苷、木犀草素、山奈酚分别作用于130、52和50个靶点。因此，它们很可能是消渴平合剂的关键多效性化合物。槲皮苷和山奈酚作为典型的黄酮类化合物，也已经被证明对糖尿病有治疗作用。赵海霞等[8]通过动物实验发现槲皮素可能通过降低 TGF-β、Smad2/3、α-SMA、Snail 的表达，促进 E-cadherin的表达，从而抑制1型糖尿病小鼠肾小管上皮细胞间质转分化和肾间质纤维化的发生发展。王兴红等[9]则发现槲皮素可能通过调控肾脏Wnt/β-catenin/GSK3β信号通路起到对糖尿病大鼠肾功能的保护作用。已有研究证明[10]，山奈酚可保护胰岛β细胞损伤，朱文瑛等[11]通过动物实验发现山奈酚可通过调节P38 MAPK信号通路对高糖引起的SH-SY5Y细胞凋亡起到保护作用，对高糖引起神经元损伤的研究具有较大意义。Li等[12]通过大鼠实验研究发现，木犀草素通过调节Nrf2介导的氧化应激和NF-κb介导的炎症反应来保护糖尿病小鼠的心脏组织。中药是一个高度复杂的系统，含有大量的成分，中药的治病作用是多种成分共同作用的结果。从调控网络中也可以发现，消渴平合剂的多个化合物具有相同的靶点，或许可以提供协同效应。

我们将消渴平合剂治疗糖尿病的靶点进行生物过程、细胞成分和分子功能三方面进行GO富集分析，研究结果表明生物过程方面主要涉及细胞对脂多糖、细菌源分子和金属离子以及氧化应激的反应；细胞组分方面主要涉及RNA聚合酶转录因子复合体、膜区域、突触前膜、突触后膜；分子功能主要涉及类固醇激素受体活性、G蛋白偶联受体活性、细胞因子受体活性。胰岛β细胞去分化被认为是T2DM胰岛素分泌功能损伤的重要机制。诸多不同基因与蛋白信号途径皆对胰岛β细胞的损伤具有调节作用。有研究表明[13]，降糖三黄片可以通过下调Galectin-3、TIMP-1，抑制胰岛β细胞去分化，保护胰岛β细胞功能。Jiang等[14]发现Foxo1可以在细胞核内竞争结合Pdx-1，基因的启动子上游抑制转录活性，从而抑制胰岛β细胞的增殖。因此，消渴平合剂可能通过干扰这些生物学过程来调控胰岛β细胞。

中药复方具有多组分、多靶点、多途径作用的特点。本研究中确定了186个显著富集的通路，包括AGE-RAGE通路、凋亡、内分泌抵抗以及与IL-17、病毒感染等。AGEs是在高糖环境下的代谢产物，RAGE是低亲和力模式识别受体家族的重要成员，AGE-RAGE通过激活下游PI3K/AKT、Jak-STAT等信号通路来诱发炎症、氧化应激和细胞凋亡等，对糖尿病肾脏细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞等均有影响[15]。我们有理由推测，消渴平合剂可能是通过抑制AGEs-RAGE通路激活下游通路，减少炎症、氧化应激等相应靶细胞的损伤，从而减少糖尿病并发症的出现。在本研究中，我们还发现了与病毒感染相关的几个信号通路的富集。有学者通过研究发现[16]病毒感染与糖尿病的发生也有一定的关系，病毒感染可能通过干扰胰岛素信号转导、促进胰岛素抵抗而影响疾病的进程。在本研究中，我们还发现结肠癌、肺癌、乙肝等也显著富集，提示这些通路与糖尿病也有一定的关联性。

4 小结

本研究采用网络药理学方法预测消渴平合剂治疗糖尿病的作用机制和分子靶点。槲皮苷、木犀草素、山奈酚调节与糖尿病相关的大多数靶点。消渴平合剂可能通过细胞对氧化应激、转录因子活性、细胞凋亡等特定的生物学过程及相关的如AGE-RAGE、IL-17等信号通路来起到调节作用。JUN、TP53、MYC、STAT3、MAPK14、MAPK3、AKT1是消渴平合剂治疗糖尿病的关键基因。