二陈汤对非酒精性脂肪性肝病FXR信号通路及胆汁酸水平的影响*

崔佳斌 郑栋栋 陈 奇 江岸林

海盐县中医院 浙江 海盐 314300

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明确的肝损害因素所致的，因大量脂质在肝脏沉积，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合征，NAFLD可进一步演变为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌[1]，已逐渐成为最主要的肝脏疾病之一。二陈汤出自《太平惠民和剂局方》，由半夏、橘红、白茯苓、甘草、乌梅和生姜组成，具有燥湿化痰、理气和中之功效，广泛用于NAFLD的治疗[2]。近年来发现，法尼酯衍生物X受体（FXR）在物质代谢及肠道稳态中发挥重要的作用，通过调节胆汁酸（BA）、脂类及糖等代谢，可调控NAFLD的发展和转归[3]。本课题就二陈汤是否通过调控FXR信号通路干预NAFLD进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠51只，4周龄，体重（100±10）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于浙江中医药大学实验动物中心。适应性喂养1周后随机分成2组：对照组8只，造模组43只，对照组予常规饲养，造模组予高脂饲料喂养，高脂饲料配方：基础饲料72.6%，猪油10%，胆固醇2%，胆盐0.4%，蛋黄粉5%，蔗糖10%。造模组于造模第8、10和12周各处死1只大鼠，取肝脏组织做HE染色，判定造模情况。

1.2 药物及试剂：奥贝胆酸（美国Sigma），二陈汤（法半夏、茯苓各9g，陈皮、乌梅、生姜各6g，炙甘草3g，由海盐县中医院中药房提供）；RNA纯化试剂盒（北京天根生化），PCR试剂盒（上海士锋生物），蛋白提取试剂盒（杭州联科），FXR、小异二聚体伴侣（SHP）、胆固醇7α羟化酶（CYP7A1）和胆盐输出泵（BSEP）一抗（英国Abcom），二抗（北京中杉金桥），BA检测试剂盒（上海武昊），引物（生工生物工程）。引物序列：FXR（5’-CCATTTACAAGCCACGGACG-3’、5’-CCCAGGTTGGAATAATAGGACG-3’），SHP（5’-CTCCCCCGATGAAGGTCGAT-3’、5’-CTCTAAGACGCTCACAGTCTCT-3’），CYP7A1（5’-TGAAGAGTACCACACCAGG-3’、5’-CATCAGACTATGGCGCAGGT-3’），BSEP（5’-GGGCATCTCAAGCAAACACC-3’、5’-AATGGCATTCCCTCCAGAGC-3’）。

1.3 实验仪器：精密电子秤（Sartorius，BT-224S），高速低温离心机（Eooendorf，15R），全自动生化分析仪（北京朗普，SMT-120VP），紫外/可见分光光度计（上海谱元，α-1860），恒温水浴箱（上海精密实验，DK-S24），电子显微镜（Thermo Fihser，L120C TEM），荧光定量 PCR仪（ABI，7300），超净工作台（苏净，sW-CJ-2FD），电泳仪（Hexagon，DE214），全自动蛋白印迹处理系统（广州博鹭腾生物，WB-600Auto）。

1.4 实验分组及方案：造模12周后将造模组随机分成模型组，奥贝胆酸组，中药高、中、低剂量组，各组8只，进行药物干预。奥贝胆酸组：奥贝胆酸以成人25mg/d剂量，按体表面积换算成大鼠剂量为2.25mg/kg·d，以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂；二陈汤高、中、低剂量组：分别为4.86g/kg·d，2.43g/kg·d和1.22g/kg·d；模型组及对照组予同等剂量的生理盐水，灌胃体积为10mL/kg，2次/d，持续4周，干预期间，喂养方式不变。

1.5 样本采集：干预结束后，禁食8小时后大鼠按30mg/kg腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，腹主动脉采血、离心后，取上层血清。处死大鼠后，取肝脏左叶固定位置，修剪其大小为5mm×5mm×3mm左右，放置10%中性福尔马林溶液中固定，待HE染色。取大鼠肝右叶固定位置，2块大小约5mm×5mm×5mm左右组织，以DEPC处理过的PBS冲洗干净，分装与冻存管中，先置于液氮中，后转于-80℃保存待用。

1.6 检测指标及方法：分述如下。

1.6.1 肝脏组织石蜡切片HE染色：取大鼠肝组织常规石蜡包埋、切片（5μm）、脱蜡、脱水，苏木素-伊红（HE）染色后，在光镜下观察。

1.6.2 肝脏和血清BA检测：取50mg肝组织，以酶联免疫吸附法测定肝脏组织BA；生化仪检测大鼠血清BA。

1.6.3 Realtime-PCR检测：按Trizol Reagent试剂盒提取总RNA，检测浓度及纯度。反应条件：94℃、2min变性，95℃、40s，50℃～65℃、40s循环40次。定量分析采用公式：△△Ct=（Ct1-Ct2）-（Ct3-Ct4），Ct1、Ct2为处理样品待测基因和管家基因循环次数，Ct3、Ct4分别对照样品待测基因和管家基因循环次数。

1.6.4 Western blot检测：组织充分匀浆后提取蛋白，按提取试剂盒说明进行操作。Bradford法检测蛋白浓度后，上样进行SDS-PAGE电泳，浓缩胶80V、20min，分离胶100V、1h；转膜至PVDF膜上并以考马斯亮蓝染色，封闭2h，一抗杂交，4℃孵育过夜，洗膜后二抗杂交反应1h，最后ECL发光照相测定蛋白表达量。

1.7 统计学方法：采用SPSS 21.0统计分析软件进行计算。本试验研究均采用双侧检验，以P＜0.05作为显著性差异的标准。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，两两比较用LSD法；不符合正态分布数据以中位数表示，用非参数检验，如Wilcoxon秩和检验、Kruskal-wallis的H检验等。

2 结果

2.1 对NAFLD大鼠肝脏组织学的影响：如图1所示，正常组肝组织形态大致正常；模型组大鼠肝细胞呈中-重度脂肪变，肝细胞肿胀，细胞核被挤向一边，大量脂肪空泡充斥于包浆内，可见大小不等的脂滴，符合NAFLD病理表现；经奥贝胆酸及中药治疗后，肝细胞脂肪变有不同程度改善，脂肪空泡不同程度减少，以奥贝胆酸及中药高剂量组最为显著。

图1 肝脏病理学检测

2.2 对NAFLD大鼠肝脏及血清BA的影响：如表1和图2所示，经高脂饲料喂养后，NAFLD模型大鼠肝脏和血清BA明显升高，经药物干预后有不同程度的降低，以奥贝胆酸和高剂量组最为显著，且二陈汤各组呈剂量依赖性。说明在降低NAFLD肝脏BA方面，奥贝胆酸与二陈汤高剂量疗效相当，而在降低血清BA方面二陈汤高剂量优于奥贝胆酸。

表1 各组大鼠肝脏及血清BA对比（±s）

表1 各组大鼠肝脏及血清BA对比（±s）

注：与正常组对比，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组对比，cP＜0.01；与奥贝组对比，dP＜0.05，eP＜0.01；与高剂量组对比，fP＜0.05，gP＜0.01；与中剂量组对比，hP＜0.05，iP＜0.01。

组别正常组模型组奥贝组高剂量组中剂量组低剂量组例数8 8 8 8 8 8肝脏BA（μg/mg）25.6±4.5 106.5±14.2bc 54.6±7.4bc 43.8±7.3bcd 67.4±9.1bceg 83.6±9.3bcegi血清BA（μmol/L）4.2±1.0 14.9±2.7b 7.0±1.7bc 6.6±1.8ac 9.0±1.9bcdf 11.6±2.2bcegh

图2 肝脏及血清BA水平对比

2.3 对NAFLD肝脏FXR信号通路的影响：如图3所示，NAFLD模型组大鼠FXR、SHP及BSEP mRNA表达较正常组显著下降，CYP7A1 mRNA表达显著上调；经奥贝胆酸及二陈汤治疗后，FXR、SHP及BSEP mRNA表达具有不同程度上调，CYP7A1 mRNA表达不同程度下调，其中以奥贝胆酸及二陈汤高剂量最为显著。

图3 FXR、SHP、CYP7A1和BSEP mRNA表达的对比

对各组大鼠肝脏FXR、SHP、CYP7A1和BSEP蛋白表达的影响如图4所示，NAFLD模型组大鼠FXR、SHP及BSEP蛋白表达较正常组显著下降，CYP7A1蛋白表达显著上调；经奥贝胆酸及二陈汤治疗后，FXR、SHP及BSEP蛋白表达不同程度上调，CYP7A1蛋白表达不同程度下调，其中以奥贝胆酸及二陈汤高剂量最为显著。

图4 FXR、SHP、CYP7A1和BSEP蛋白表达的对比

3 讨论

本病可归属于中医学“肝癖”“痰浊”“肥气”等范畴，脾虚运化失权、痰湿内生是重要病机，痰、湿、浊、瘀、热为主要病理因素[4]。由于现代饮食结构及生活方式的改变，饮食因素在本病的发生发展中占有主导地位[5]。《儒门事亲》：“膏粱之人，奉养过度，起居闲逸，酒食所伤，以致中脘留饮胀闷。”[6]痰湿停滞于脏腑、经络，妨碍气血运行，致气血瘀滞、痰瘀互结，产生新的致病因素。学者统计发现，湿浊内停证在NAFLD中占34.5%，是最常见的证型[7]。二陈汤是治疗痰湿的代表方，亦是基础方，广泛用于NAFLD等代谢综合征。

就本病发病机制而言，我们对本病的认识，从最早的“二重打击”学说逐渐发展到目前的“多重打击”学说[8]。临床研究发现NAFLD患者血清胆汁酸水平明显升高[9]，Thompson等[10]亦发现NAFLD小鼠胆汁酸池增大，胆汁酸组成改变，提示胆汁酸过多引起的细胞毒性亦参与了本病的发生发展。胆汁酸是胆汁的主要成分，在肝脏依赖CYP7A1生成后，由BSEP泵入胆小管，储存于胆囊，最后排放入小肠发挥生理作用[11]。

FXR可通过调节胆汁酸代谢，干预NAFLD的进展。无论是人还是动物研究均发现，FXR表达下调与NAFLD进展间存在正相关[12]。FXR激活后诱导SHP的表达，可促使肝脏核受体-4与肝受体同源物-1结合的共活化物解离并失活，从而降低对CYP7A1的转录活化作用，抑制胆汁酸的生成；此外，FXR还通过上调BSEP的表达促进肝脏分泌胆汁酸，并使胆汁酸转变为胆汁，从而增加胆汁酸的排泄[13]。

本研究首次发现，二陈汤可激活NAFLD大鼠肝脏FXR，进而上调SHP及BSEP，抑制CYP7A1的表达，从而降低肝脏及血清BA水平，改善肝脏脂肪病变情况，且二陈汤激活FXR信号通路的程度呈剂量依赖性。综上所述，本研究为临床二陈汤治疗NAFLD提供了一定的理论支撑。