降解山楂汁中柠檬酸乳酸菌株筛选及降酸工艺优化研究

高 雅，王 琛，李 潇，张晓黎，韩艳秋，吴兴壮

（辽宁省农业科学院食品与加工研究所，沈阳 110161）

山楂果实中有机酸特别是柠檬酸含量很高[1]，很大程度影响加工成品的市场消费。为使山楂果汁达到合适的糖酸比例，在加工过程中会添加大量的糖来改善口感，但这样会导致市场上的山楂果汁含糖量较高，与目前流行的低糖消费理念大相径庭[2]。目前，果汁或果酒采用的降酸方法有化学降酸法、物理降酸法和生物降酸法，但化学降酸法对产品品质有较大影响，物理降酸法易导致产品稳定性变差，而生物降酸优势则非常突出[3]。以植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、柠檬明串珠菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌7种乳酸菌为研究对象，比较菌株在柠檬酸培养基中的生长曲线及其在山楂果浆中的生长情况和降酸效果，筛选出可代谢柠檬酸的乳酸菌，从而实现山楂汁的有效降酸。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂：购置于农贸市场；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LNJ005 由研究单位自行分离保存；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）BNCC194390、短 乳 杆 菌（Lactobacillus brevis）BNCC337373、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）BNCC134415、柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）BNCC194779、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）BNCC186447、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）BNCC189793：购自北纳创联生物技术有限公司，菌种分别编号为G1-G7。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD 型单人单面工作净化台：上海沪净医疗器械有限公司；CJ50-3叠加式培养箱：上海程捷仪器设备有限公司；YXQ-LS 立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；756型紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；5975C 液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）：安捷伦科技有限公司。

1.3 培养基的制备

液体MRS 培养基配置：葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.4%，牛肉膏0.5%，乙酸钠0.5%，柠檬酸三铵0.2%，磷酸氢二钾0.2%，硫酸锰0.005%，硫酸镁0.02%，吐温-80取1 mL，121 ℃灭菌20 min。

柠檬酸液体培养基配置：在MRS 液体培养基的基础上加20%柠檬酸。

1.4 试验方法

1.4.1 基础理化指标测定方法 pH 值用pHS-3C 雷磁pH计测定；总酸（以柠檬酸计）采用酸碱滴定法测定，参考GB/T 15038—1994；柠檬酸参照国家标准GB 5009.157—2016 食品中有机酸的测定（高效液相色谱法）；含量计算采用归一化法。

1.4.2 山楂果浆制备方法 取市售无霉烂变质、成熟度基本一致的新鲜山楂，洗涤去核后按1∶1 加水，加热软化，随后打浆。冷却后加入果胶酶(1 mL/L)，再置于53 ℃水浴中浸提，经压榨过滤制得山楂果浆。

1.4.3 试验菌株生长曲线的测定 将7 株试验菌株在液体MRS中活化培养24 h，调节OD600值为1.00，以2%（v/v）接种量将对数生长期的菌株扩大培养，再以2%的接种量接入柠檬酸培养基中。27 ℃下每隔2 h 测定OD600值，并绘制菌株生长曲线，从而对菌株进行筛选。

1.4.4 试验菌株在山楂果浆中的生长情况 将7 株试验菌株培养至对数生长期，以4%（v/v）的接种量接入山楂果浆中，接种后每隔24 h 取样进行活菌计数，分析不同试验菌株在山楂果浆中的生长能力。

1.4.5 试验菌株在山楂果浆中的降酸效果 将7 株试验菌株培养至对数生长期，以4%（v/v）的接种量接入山楂果浆中，接种后发酵12 d 取样，测定其pH 值及总酸、柠檬酸含量，分析菌株对山楂果浆的降酸能力。降酸能力以柠檬酸的减少率来计算。

1.4.6 降酸工艺优化研究 取50 mL 山楂汁装入锥形瓶中，并根据之前的筛选结果，选取具有较好降酸效果的菌株，再通过单因素分析来确定发酵温度、发酵时长、菌株接种数量下降酸率的变化情况。选择3种指标的优势范围，进行三因素三水平的降酸率分析。

1.4.7 数据处理 采用SPSS 19.0软件进行相关数据分析。

2 结果与分析

2.1 试验菌株的生长曲线

在柠檬酸液体培养基中开展菌株筛选试验，发现共有7种菌株能与柠檬酸发生反应。绘制7种菌株的生长曲线，如图1所示。

图1 各菌株生长曲线Figure 1 Growth curves of each strain

从图1中可以看出，菌株在24～28 h 的扩增数据较快，G7菌株在28～40 h扩增数据较快，调整期约为8 h，之后进入对数增长期，最后趋于稳定。G1 与G5菌株在液体培养基中菌数较多，而G3 和G4 最少，且生长能力弱、生长缓慢。因此，得出植物乳杆菌G1和柠檬明串株菌G5 生长能力较强，可作为降柠檬酸的菌株。

2.2 试验菌株在山楂果浆中的生长情况

将7个菌株应用于山楂果汁中，可显著改善其发酵性能，促进其发酵过程。乳酸菌发酵的活菌数变化情况如图2所示。

图2 乳酸菌发酵的活菌数变化Figure 2 Changes in the number of viable bacteria of lactobacillus fermentation

在山楂汁的发酵环境中表现出了足够快的代谢速度和增殖速度，并保持了良好的生长势头。在培养初始状态下，G5菌株的活菌数略高于其他菌株的活菌数。随着培养时间的增加，7 种菌株的活菌数呈现出逐渐上升的趋势，并逐渐接近，到达12 h 后，活菌数则呈现出下降趋势，表明在一定时间内，菌株数量不再增加，但是G5 菌株的数量始终高于其他菌株，由此可以得出G5 菌株在山楂汁的发酵环境中表现出了足够快的代谢速度和增殖速度。

2.3 试验菌株在山楂果浆中的降酸效果

测定试验菌株发酵后在山楂果浆中的酸性指标，见表1。

表1 试验菌株发酵后在山楂果浆中的酸性指标Table 1 Acid index of test strains in hawthorn pulp after fermentation

由表1 可以看出，菌株发酵后，山楂果浆的总酸含量变化并不明显，而pH值均高于对照组，表明发酵过程中微生物促使新的有机酸转化产生。通常情况下，乳酸菌发酵代谢会产生乳酸，这就说明乳酸对降酸有一定的影响。各菌株在山楂果浆中的降酸率如图3所示。

图3 试验菌株在山楂果浆中的降酸效果Figure 3 The acid lowering effect of the test strains in the hawthorn fruit pulp

由图3 可知，植物乳杆菌和柠檬明串株菌的降酸率依然最好，可能因为这两种菌在山楂果浆中具有生长优势，对山楂果浆中的柠檬酸具有较好的转化作用。

2.4 菌数降酸率响应面试验

选取菌株G5柠檬明串株菌进行降酸响应面试验研究，通过单因素试验，分别选取发酵温度（A），发酵时间（B），菌株接种量（C），并以降酸率（Y）为响应值。通过Box-Behnken法进行响应面试验优化，各因素水平见表2。

表2 菌数降酸率响应面因素及水平Table 2 Factors and levels of acid reduction rate response surface of bacteria number

2.4.1 响应面试验结果 响应面试验设计表及结果见表3，回归方程方差分析见表4。

表3 响应面试验设计表及结果Table 3 Response surface test design table and results

表4 回归方程方差分析Table 4 Variance analysis of the regression equations

通过Design-Expert 8.0 软件对试验数据进行了计算和分析，得出的三元二次回归方程如下：降酸率=74.890 00+0.392 50×A-1.355 00×B-1.027 50×C-0.222 50×A×B-1.872 50×A×C-1.622 50×B×C-8.388 75×A2-5.268 75×B2-2.858 75×C2。

对于菌种降酸工艺优化模型的P＜0.05，此回归模型显著，失拟项（P=0.136 1＞0.05）不显著，决定系数为R2=0.998 7，RAdj2=0.997 1，表明该模型与试验拟合较好，可适用于分析乳酸菌种降酸工艺优化。从表4 可以看出，菌种接种量（A），P＜0.05 对曲面的影响效果显著；发酵时间（B），发酵温度（C），交互项AC、BC（P＜0.000 1），对曲面的影响效果极显著；二次项A2B2C2（P＜0.000 1）极显著。从表中F 值可以得出各个因素对降酸率的影响次序为：菌种接种量（A）＜发酵温度（C）＜发酵时间（B）。

2.4.2 响应面分析 各因素交互作用对降酸率的影响响应面分析如图4所示。

图4 各因素交互作用对降酸率的影响响应面分析图Figure 4 Response surface analysis diagram of the interaction of various factors on acid reduction rate

由图4 可知，随着发酵时间与发酵温度、菌种接种量与发酵温度的逐渐增加，降酸率呈现先上升再平缓下降的抛物线；菌种接种量与发酵时间的增加，使降酸率迅速下降，证明了这些交互作用的因素对降酸率影响较大，这与表4显示结果相呼应。

2.4.3 验证试验 通过响应面设计试验结果分析，当菌种接种量为4.9%，发酵时间59 h，发酵温度28.2 ℃，此时降酸率可达75.117%。为了使试验操作更简单易行，将最佳条件修正为：菌种接种量为5%，发酵时间60 h，发酵温度28 ℃。经3次平行实验，测得此时降酸率可达75.11%，由此可证明该响应面模型合理可靠。

3 结论

试验通过比较7 种菌株在柠檬酸培养基中的生长曲线及其在山楂果浆中的生长情况和降酸效果，筛选出了最适合降低山楂汁中柠檬酸的乳酸菌。之后对柠檬明串珠菌G5 的降酸情况进行响应面试验分析，结果表明：发酵温度为28 ℃、发酵时间为60 h、菌株接种数量为5%的情况下，山楂汁降酸率均值达到75.11%。利用此项乳酸菌发酵工艺生产山楂汁，可以使山楂汁酸度降低，口味柔和。