牛支原体病的诊断与防控相关研究进展

王仕江，黄光云，2

（ 1． 南丹县农业农村局，广西 河池 547200 ； 2． 广西农业职业技术大学畜牧研究院，广西 南宁 530001 ）

牛支原体属于柔膜体纲、支原体属，是介于细菌和病毒之间的最小、最简单的能够进行自我复制的原核微生物，目前已分离鉴定出与牛病相关的支原体有20多种，牛支原体是其中一种。牛支原体可引起肺炎、乳房炎、关节炎、结膜炎等，其中以引发呼吸系统疾病最常见[1]。1961年，有学者首次从患乳腺炎的牛分泌的牛乳中分离到牛支原体[2]；而出现呼吸道症状的病例则于1976年首次被报道。2008年，我国首次从患病犊牛肺脏中分离到牛支原体，之后国内十多个省市陆续发生了牛支原体病，严重影响了我国养牛业的发展[3]。牛支原体肺炎的临床症状和病理变化与牛传染性胸膜肺炎极为相似，对相关疾病的临床诊断造成了困难。而且目前临床中防控牛支原体病仍以使用抗生素为主，耐药株的出现对该病的临床防控也造成了一定阻碍。基于此，本文对牛支原体病的流行病学及临床症状进行简单总结，主要梳理近年来牛支原体诊断及防治方法的研究进展，以期为国内大多数地方开展牛支原体病的防控工作提供参考。

1 流行病学

牛支原体病的流行与疫区牛群的流动存在密切关系，牛一旦感染支原体很难根除，且携带时间可长达数年。支原体病的主要传染源是患病牛和携带牛，自然感染5～7 d后，患病牛排出大量病原，传播途径主要为飞沫传播、哺乳传播、交配传播等。此外，人工授精也是传播该病的常见途径，可引起睾丸炎、精囊炎，导致精子质量降低[2]。牛支原体病的发生受到饲养管理、消毒情况以及牛自身的健康情况等多种因素的影响，一般情况下，冬季养殖场的卫生和条件受限，发病率更高。此外，由于康复患牛可持续带毒，导致感染牛支原体的养殖场会变成隐性流行区域。牛支原体感染肉牛和奶牛，肉牛易感性更强；以1周龄内的犊牛最为易感，病死率极高。

2 临床症状

牛支原体病可引起肺炎、乳腺炎、关节炎、耳炎等多种症状表现，不同年龄段的牛会出现不同的症状[4]。

2.1 呼吸系统疾病

自然感染牛支原体发生呼吸系统疾病多为犊牛，临床中一般分为最急性型、急性型和慢性型。最急性型在临床中较罕见，主要表现为体温突然升高超过41.5 ℃、精神萎靡、呼吸急促等，病程一般为2～3 d，病情严重者甚至在1 d内就会死亡[5]。急性牛支原体肺炎患牛表现发热、持续分泌鼻涕，精神沉郁，反刍能力下降，咀嚼能力下降，颈部弯曲，眼球肿胀，病程一般为7～10 d，若在此阶段内不发生死亡，病牛大多向慢性型转变。慢性型是牛支原体肺炎最普遍的一种形式，临床症状较轻微，主要表现为被毛暗淡、体弱多病，部分病牛出现痢疾、咳嗽等[6]。

2.2 乳房炎及关节炎

感染牛支原体的奶牛多数只有一个乳区出现症状，部分两个或更多乳区发生炎症。患病乳区触诊硬实，表现为发热、肿胀，患病早期乳汁呈水样，其中混有絮状物；随着病情发展，乳汁变为淡棕黄色浆液样物质，甚至脓化[7]。出现关节炎症状的患病牛关节腔内出现大量积液，滑膜组织增生，关节周围软组织出现干酪样坏死物。

2.3 耳炎

牛支原体引起耳炎的发病机制尚不清晰，推测可能与咽部有关。因为咽鼓管连接鼓室与咽部，口腔中的病菌由此进入中耳，并随着病程持续进入内耳，引发耳炎。部分牛出现头颈歪斜等神经症状，以2～18周龄居多。

3 病理变化及实验室诊断方法

根据患病牛的临床表现及病理变化可作出早期判断，也可采用触诊、听诊等方法进行辅助检查，但若要确诊仍需运用实验室技术加以鉴别。常用的实验室技术包括分离培养、涂片镜检及血清学、免疫学、分子生物技术等[8]。

3.1 病理变化

解剖患病牛可见病变的主要位置是心脏和肺部，主要表现大叶性肺炎，整个心叶、尖叶和大部分膈叶发生实变，膈叶残存的相对正常的肺组织出现肺气肿；心衰，心肌质软，横径增宽，心内膜出血明显。出现关节炎症状的患病牛两前肢腕关节周围出现较明显的坏死化脓灶，四肢的关节液黏稠且量增多[9]。

3.2 触诊和听诊

对病情较重的肉牛，听诊时能够听到肺泡音变淡或消失，呼吸音也多为摩擦声；对支气管进行听诊会发现有明显的啰音和胸腔的摩擦声。

3.3 分离培养和涂片镜检

无菌采集病料，使用类胸膜肺炎微生物培养基进行病原微生物培养，2～3 d 后用显微镜观察固体培养基表面有无出现“煎蛋型”支原体典型菌落，液体培养基是否由红色变为黄色透亮，若是则需进行下一步的生化试验。病料直接涂片镜检，也可作为辅助诊断方法。但病原培养和镜检不适合进行快速临床诊断，并且对操作人员具有一定要求，不适用于生产实践。此外，感染肉牛的鲜血还可以用于检测牛支原菌感染的凝血试验[10]。

3.4 血清学方法

目前常用的血清学检测技术为ELISA 和胶体金免疫层析法。王艳芳等[11]获得牛支原体延伸因子EF-Tu 蛋白并建立EF-Tu间接ELISA法，结果表明该方法适合大规模的血清学诊断检测。金云云等[12]以牛支原体全菌蛋白经超声波裂解后的裂解物作为包被用抗原，建立检测牛支原体血清抗体的间接ELISA 方法。使用该方法检测牛布氏杆菌病、牛病毒性腹泻黏膜病抗血清均无交叉反应，具有良好的特异性。刘洋等[13]比较了3种抗牛支原体血清抗体的ELISA 试剂盒检测效果。ELISA 法多应用于临床检测和流行病学调查[14-16]，但该方法也存在可能出现假阳性的情况。周华倩等[17]建立了牛支原体抗体的胶体金免疫层析试纸条；田可昕等[18]以牛支原体MilA基因重组蛋白P300为检测靶标抗原包被检测线，山羊抗家兔IgG包被质控线，金黄色葡萄球菌蛋白A 标记胶体金溶液，建立牛支原体抗体胶体金免疫层析试纸条检测方法，上述试纸条经验证试验表明均可应用于牛支原体抗体现场快速检测、群体监测和辅助诊断。

3.5 免疫组织化学技术

免疫组织化学技术是利用抗原与抗体间的结合、组织化学染色，对抗原、抗体进行定量分析，能够准确判断是否有病原感染，还可清晰地反映病原在组织器官和细胞中的定位及分布，具有很高的检出率和准确度[19]。金云云等[20]建立检测牛支原体的间接免疫组织化学方法，分别以鸡抗牛支原体免疫球蛋白Y（IgY）、羊抗鸡IgG-HRP 为一抗和二抗，对牛支原体菌体涂片和牛支原体阳性肺脏组织切片进行免疫组化染色。结果显示，试验建立的间接免疫组化方法可应用于检测临床病例组织样本及培养物中的牛支原体，具有特异性和可靠性。

3.6 分子生物学方法

目前，分子生物技术的研究有两大类:聚合酶链反应（PCR）和环-等温扩增技术（LAMP）。PCR 技术是一种灵敏度高、专一性好的方法，但对技术和设备的使用要求很高，不适合在临床上推广。包世俊等[21]参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R，建立了牛支原体PCR检测方法，检出率与病原分离的符合率为100%。杨丽等[22]建立了可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的单一和混合感染鉴别诊断的三重PCR 检测方法，具有快速、准确、简便的特点。LAMP技术的操作方法比PCR技术简单，设备条件也比较简单，适用于临床，但目前该技术还不完善，且使用比较少见[23]。范情等[24]建立的二重荧光LAMP 检测方法灵敏度高、特异性好、重复性好，能够同时检测大量样本，可用于牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的临床检测和流行病学调查。金云云等[25]基于牛支原体P81基因建立的LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、检测快速准确，且不需要专门的仪器设备,可用于牛支原体临床检测。吴彤等[26]研制了一种检测牛支原体的等温扩增冻干试剂盒，具有敏感性高、特异性好、稳定性好、操作便捷等优点，适合基层兽医现场检测使用。

4 防治方法

4.1 预防措施

饲养场坚持“自繁自养”的原则，若必需引进的情况下，应严禁从疫区引进并在引进前进行严格检疫。选定引入牛后，应尽可能缩短运输路程，若引入犊牛应保证已断奶一个月。肉牛引入养殖场后，必须进行30～45 d 隔离观察，隔离期结束后重新检疫，通过后方可入群[27-29]。严格划分牛场生活区、生产区，并设立专用的隔离区和兽医室，在入口处设置消毒池；建立定期消毒制度，每个月必须消毒，转群、出栏、进牛前消毒，健全的防疫和驱虫制度，定期进行预防和驱虫。疫情发生时应认真做好相应工作，严格控制疫情范围，并做好消毒、净化等工作[30]。牛群一旦发生疫病，必须立即进行隔离和治疗，若病情严重不能治愈，必须马上进行无害化处理。对病牛及周围进行彻底消毒，每日可按实际情况进行1～2次消毒。为提高肉牛的生产效益，必须进行科学的饲养管理。肉牛到新的养殖场后的隔离饲养期间要注意驱虫、健胃，密切关注肉牛的日常生活习惯，如采食、排泄等，并根据其行为习惯科学地调节管理方式。做好牛群饲养后的日常管理，营造舒适的生长环境，确保其生长速率和肥力，加强舍内通风，保持舍内的温度和湿度。

4.2 疫苗免疫

牛支原体无细胞壁，对常规抗菌药物不敏感，且易产生耐药性。因此，疫苗免疫成为预防牛支原体病的重要方向[4]。牛支原体疫苗多为弱毒疫苗和灭活疫苗，以预防控制呼吸道疾病症状为主，如牛支原体相关五联苗、牛支原体单价苗等[31]。此外，关于牛支原体的亚单位疫苗也已开展了大量的研究。牛支原体膜蛋白具有良好的免疫原性，可作为牛支原体疫苗的候选[32]。白宇彤等[33]研究发现，牛支原体重组MBOVPG45_0212 蛋白具有良好的免疫原性和反应活性，为后续牛支原体生物学功能研究及疫苗研发奠定了基础。黄志成等[34]研究成功制备牛支原体重组LppB蛋白及其多克隆抗体，为LppB功能研究奠定基础。

4.3 治疗措施

牛支原体对常规使用的抗菌药物具有耐药性，特别是土霉素、替米考辛和壮霉素[35]。临床中对牛支原体病的治疗方式以对症治疗为主。针对出现呼吸道症状患牛，症状较轻者可在日粮中混入12 mg/kg左氧氟沙星治疗[36]；严重者可静脉注射10%葡萄糖注射液200 mL+10%氯化钠注射液150 mL+40%乌洛托品30 mL+维生素C 注射液40 mL+地塞米松磷酸钠7.5 mL+头孢噻呋钠1 g，连续用药3 d[35]。为预防病牛出现肺水肿，可肌肉注射30%替米考星，连续用药2～3 d。呼吸困难、体质衰弱的病牛可肌肉注射5～10 mg/kg 硫酸卡那霉素+5 mg/kg 酒石酸泰乐菌素+0.1 g/kg 黄芪多糖；若病牛已对硫酸卡那霉素有抗药性，可替换为氟苯尼考注射液。大环内酯类及四环素类抗生素能够治疗其他器官的支原体感染，但对支原体乳腺炎无疗效，因此治疗支原体引起的奶牛乳腺炎首选药物是氟喹诺酮类，也可使用红霉素或阿奇霉素[7]。随着中兽药在畜禽养殖中的应用愈发广泛，有关中药治疗牛支原体病的试验研究逐渐增多。如由板蓝根、黄连、金银花、黄芩、知母、甘草组成的复方制剂可用于治疗牛支原体肺炎；而且牛支原体对两面针、甘草、黄檗等均具有较好的敏感性[37]。

5 结论

牛支原体病是肉牛生产中一种常见的传染病，若不及时治疗会对肉牛的健康产生很大危害。为此，农场主和兽医均需要采取相应的措施，采用科学的诊断和控制技术，为肉牛养殖户的经济发展和生产经营提供保证。