牛冠状病毒病诊断及防治的研究进展

李小龙，石亚楠，鲍显伟，李 昊，王雪妍，许立华

（ 宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021 ）

冠状病毒（coronaviruses，CoV）可感染家畜、家禽、野生动物和人类，其中牛冠状病毒（bovine coronaviruses，BCoV）所引发的牛冠状病毒病在全球大范围存在，可引起肠道和呼吸道双重临床症状，给畜牧业造成了严重的经济损失。CoV 是非节段的单股正链RNA 病毒，也是目前已知基因组最大的RNA 病毒，长度约为26～32 kbp。CoV 亚科可分为Alpha（α）、Beta（β）、Gamma（γ）和Delta（δ）等4 个属，又因为同一属中复制酶结构存在差异而划分为不同谱系，BCoV属于β属。本文对牛冠状病毒病的病原学、流行病学、致病机制、鉴别诊断和预防等方面的研究进展进行了综述，旨在加强对牛冠状病毒病的认知，为该病的防控提供参考。

1 牛冠状病毒病病原学

1.1 培养特性

分离培养BCoV 的细胞主要包括非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞）、绵羊胎肾细胞、胎牛胸腺细胞和牛肾细胞（MDBK 细胞）等细胞系。Storz 等[1]研究表明，分离培养BCoV 时添加适量胰酶可对病毒增殖和出现细胞病变（cytopathic effect，CPE）等发挥重要作用。

1.2 基因组学

迄今为止，BCoV 只有一种基因型。BCoV 的基因组约31 kb，其中包括10 个开放阅读框（open reading frame，ORF）以及两侧的5'非翻译区（5'UTR）和3'非翻译区（3'UTR）。ORF1 约占5'端2/3 的基因序列，可分为ORF1a和ORF1b，分别翻译为复制酶多聚蛋白pp1a 和pp1ab，之后被蛋白水解酶（主要为木瓜样蛋白酶和3C样蛋白酶）切割成数种非结构蛋白（non-structuralprotein，NSP）[2]。ORF4、8、9 和10 分别编码结构蛋白棘突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），其他ORF编码额外的NSP。一些β属病毒编码一种凝集素酯酶辅助蛋白，称为血凝素-酯酶蛋白（HE）[3]，基因组基本结构为5'UTRORF1a-ORF1b-HE-S-E-M-N-3'UTR-3'端聚腺苷酸尾。HE 蛋白在病毒表面形成穗状突起，作为一种血凝素能够与细胞表面的9-O-乙酰神经氨酸结合，外在表现为能够凝集多种动物的红细胞。HE 蛋白具有乙酰酯酶活性，可与糖蛋白膜表面的唾液酸结合，通过与含有9-O-乙酰化唾液酸的细胞表面结合使细胞受体失活，这种能力对病毒的传染性至关重要[4]，并可作为第二种病毒附着蛋白启动感染。此外，HE蛋白在体内外均可诱导产生中和抗体[5]。

S 蛋白含有大量抗原表位，主要的生物学功能是参与病毒与靶细胞的附着以及病毒和细胞膜的融合。S蛋白与细胞受体之间的相互作用是CoV 宿主范围和组织向性的主要决定因素。S蛋白由细胞胰蛋白酶样蛋白酶介导分裂为S1和S2亚基。S1亚基上的受体结合结构域能够连接细胞受体[6]，以及诱导中和抗体合成和负责血凝活性。S1亚基可能与宿主范围和组织向性有关[7]，CoV感染始于S1结构域跟宿主细胞表面受体的结合。S2 蛋白则能够介导感染期间病毒和宿主细胞的膜融合。

E 蛋白是一种小型的膜结合型蛋白，在病毒内有少量存在，分布在病毒的包膜上，作为离子通道发挥作用，与M蛋白共同参与表达病毒包膜的形成、组装与释放[8]。M 蛋白是CoV 外膜的主要成分，是病毒粒子中最丰富的蛋白质[9]，还参与病毒出芽:当病毒在出芽时陷于膜内部分M蛋白的羧基末端进入核心，可维持病毒核心结构，同时加快病毒的出芽和增殖。N 蛋白与其余4 种结构蛋白不同，由细胞质内的游离核糖体合成；N蛋白包裹基因组形成核蛋白复合体，起到保护病毒遗传物质的作用；还可与宿主蛋白结合，参与病毒转录、翻译、复制、免疫调节等多个进程。此外，因为核衣壳蛋白序列高度保守，所以N 蛋白通常是病毒RNA检测分析的主要靶蛋白[10]。

2 牛冠状病毒病流行病学与致病机制

2.1 流行病学

目前，BCoV 在世界范围内广泛分布。Kim 等[11]于2019年1月—2021年6月采集韩国患有腹泻的未断奶犊牛粪样846 份，阳性检出率为5.9%。David 等[12]采集了以色列境内2017—2021 年2～6 岁发生冬季痢疾的病牛的粪便和直肠拭子853 份，使用RT-qPCR 方法进行检测，阳性检出率为29.3%。杨海峰等[13]对我国14 个省份的数个规模化养殖场中表现呼吸道症状的176头犊牛采集咽拭子，阳性检出率为21.59%。邓飞等[14]对2020年3月—5月间四川387 份出现明显腹泻症状病牛的粪便样品进行检测，阳性检出率为16.8%。Zhu等[15]采集黑龙江省表现明显腹泻的牛粪样1 016份、鼻拭子367份，经检测其中粪检阳性率为12.20%、鼻拭子检阳性率为21.53%。

BCoV 主要通过呼吸道和消化道进行传染，故一般成群发病，且痊愈牛仍能够通过呼吸道分泌物或排泄物持续排毒，病毒可在空气、饮水、垫料等外界环境中长时间存在。BCoV的主要易感动物是牛，但在马、骆驼等家畜以及犬和鹿、长颈鹿等动物身上也检测出了“类BCoV”[16-17]。这些病毒经ELISA、免疫荧光等抗BCoV抗体检测，结果均为阳性，证明其与BCoV 存在交叉免疫。BCoV 具有如此广泛的宿主范围可能是因为S 蛋白的变异[18]；也有学者认为是由于HE 蛋白的存在，该蛋白使病毒能够与不同类型的细胞结合[19]。

2.2 致病机制

BCoV 主要通过气溶胶-鼻途径和粪-口途径传播，BCoV对细胞的入侵取决于病毒表面S蛋白与细胞受体相互作用，其对牛上呼吸道组织细胞和肠组织细胞的亲嗜力较强。首先，HE 蛋白和S 蛋白参与病毒和宿主细胞的黏附，经细胞膜融合使得核衣壳进入上呼吸道组织上皮细胞或肠上皮细胞内。近年来，有研究提出CoV识别结合宿主细胞，可能使用双受体结合基序系统[20]。病毒正链RNA在细胞质内利用宿主的复制酶体系完成基因组复制，被翻译成复制酶多蛋白，之后CoV 编码蛋白酶，以切割复制酶多蛋白生成数种单独NSP，许多NSP 聚集组装成复制-转录复合体（replicase-transcriptase complex，RTC）并负责基因组复制和亚基因组RNA的转录[21]。复制酶以负链RNA作为模板复制出互补负链RNA，并转录为正链RNA 和亚基因组mRNAs，而后者将作为结构蛋白和辅助蛋白的模板[22]。亚基因组翻译表达结构蛋白HE、S、E、M和N，完成翻译后的M、S 和E 蛋白进入内质网，随后转运至高尔基体，形成内质网-高尔基体中间体（ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC）[23]。N 蛋白与病毒基因组结合形成的螺旋核衣壳，而ERGIC 与具有结构蛋白的膜结合，形成新的、成熟的病毒体。子代病毒主要分布在内质网和高尔基体表面，最终在胞质空泡的平滑细胞膜区域以出芽的方式使细胞膜发生破裂[24]，进而侵入其他细胞。

BCoV通过肠道感染时，肠绒毛生长受到影响，肠上皮细胞死亡、脱落，并被未成熟的肠上皮细胞取代，出现小肠绒毛发育不良以及结肠嵴萎缩等现象[25]。BCoV以气溶胶的形式感染上呼吸道并在呼吸道上皮细胞中繁殖，破坏呼吸道中纤毛清除功能，使机体易受其他病原体感染，在环境选择压力下继发感染的可能性会上升；同时感染后期BCoV 感染的组织抑制干扰素及促炎细胞因子的释放，造成免疫抑制[26]。且在试验性感染中，BCoV 在动物上呼吸道中大量复制后，动物会吞咽含有该病毒的黏液分泌物进入胃肠道，通过黏液分泌物包裹的方式可能使这种不稳定但具有传染性的BCoV转移到肠道，导致肠道感染和通过粪便排出体外[27]。

3 牛冠状病毒病临床症状

根据不同毒株、不同感染部位，BCoV所导致的临床表现也有所不同。BCoV依据其分离病料不同（牛鼻分泌物、肺组织和腹泻粪便）可分为牛呼吸道冠状病毒（BRCoV）和牛肠致病性冠状病毒（BECov）[28]，其中BECoV还可进一步细分为犊牛腹泻和冬季痢疾[29]。犊牛腹泻主要见于1～2周龄的犊牛，排出淡黄色或灰白色水样粪便，严重时排出血便；腹泻导致机体水与电解质流失，严重时可引起机体脱水、酸中毒[30]。牛冬季痢疾主要是成年牛于冬季发病，患病牛表现腹泻，眼鼻分泌物增多，若泌乳奶牛感染还表现为泌乳量下降并且影响之后的生产性能。BRCoV可感染不同年龄段的牛，多见于2～6月龄的牛，临床表现为鼻炎、流鼻涕、呼吸困难、咳嗽和发热等，若与其他呼吸道疾病的病原体混合感染则会出现支气管肺炎、间质性肺炎和坏死性大叶肺炎，导致病情加剧及牛群病死率增加。

4 牛冠状病毒病诊断技术

4.1 病毒分离

一般采集病牛的粪便、血样、鼻拭子或病死牛的远端肠组织、肺组织等临床样品进行BCoV的分离，但该检测方法存在试验条件严格、操作步骤复杂和费时费力等缺点，一般不应用于临床检测。

4.2 免疫学检测

4.2.1 免疫组织化学技术

免疫组化技术原理是通过荧光素、金属离子、同位素等标记BCoV 抗原或与BCoV 相结合的特异性抗体，对病毒在组织中进行定位、定性及相对定量的检测技术。在试验中使用针对BCoV的高免疫抗血清或单克隆抗体进行免疫组织化学染色，以检测冰冻或石蜡包埋的呼吸道或肠道组织中的病毒抗原[31]。但高免疫抗血清或单克隆抗体制备时间长，耗费高，不适用于大规模检测。

4.2.2 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）

刘合义等[32]、胡林杰等[33]、李晨露[34]建立了基于BCoV N蛋白的抗体间接ELISA，经临床检测，其结果与病毒中和试验结果符合率很高。上述研究结果表明，与其他血清学检测方法相比，ELISA的敏感性更高，操作更加简便，更适用于大规模样品的检测。

4.2.3 中和试验

病毒中和试验是诊断BCoV 的金标准，其原理是在适当条件下使病毒与抗体相互反应，之后将混合物接种到敏感的宿主体内，再测定残存的病毒感染力的一种方法。中和试验具有较高的敏感性和特异性，但操作复杂，试验要求高，耗时长，因而很少在临床检测中使用。

4.2.4 血凝与血凝抑制试验

BCoV的HE蛋白能够凝集多种动物的红细胞，据此可通过血凝与血凝抑制试验对BCoV进行诊断。陆承平[35]曾在BCoV的流行病学调查中应用了血凝与血凝抑制的方法进行检样，结果显示，该方法的检测结果与中和试验、ELISA法的检测结果相关度均较高。

4.3 分子生物学检测

4.3.1 RT-PCR及多重RT-PCR

刘合义等[36]建立了检测BCoV 的RT-PCR，结果显示该方法反应速率快，特异性强，最低可检测到1个半数组织培养感染剂量（TCID50）的病毒含量。但BCoV常与其他病毒混合感染，如牛轮状病毒，因而生产中需要同时检测多种病原的方法。柳强等[37]、候佩莉等[38]、季彬等[39]建立了检测包括BCoV 的多种病毒的多重RT-PCR 方法，均具有很好的特异性和敏感性，可应用于多种病毒性疾病的快速诊断。Cho 等[40]建立了以N 基因为靶点的巢式PCR，具有较高的敏感性，最低检出限度为2×102TCID50/0.1 mL。

4.3.2 实时荧光定量PCR

沈付娆等[41]建立了BCoV SYBR GreenⅠq-PCR方法，最低检测限为7.8 copies/μL，与牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均无交叉反应，批内、批间重复变异系数均低于1.5%。谭烁等[42]建立了BCoV Taq Man qRT-PCR，对重组质粒标准品的检测下限为33.6 copies/μL。彭志豪等[43]、刘梦瑶等[44]建立的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法，均具有较好的特异性、敏感性及重复性。

4.3.3 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP 针对靶基因的6 个区域设计4 种特异性引物，通过链置换性DNA 聚合酶的作用下仅需数十分钟；具有高效、方便、快速和特异性强等特点。韩廷义等[45]建立了检测BCoV 的RT-LAMP 技术，针对冠状病毒的N 基因设计引物，最低可检出50 个拷贝的RNA；且完成了可视化，能够通过肉眼进行试验结果的观察。随着疾病诊断技术不断变革，第三代PCR、微流控芯片、纳米金LAMP标记技术、规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）技术等技术与生产应用结合的愈加紧密。因此，在实际生产中应根据各种技术的优缺点选择适合当时环境的方法进行检测，以达到高效、准确和快速的目的。

5 牛冠状病毒病治疗与预防

截至目前仍没有针对BCoV 的特定治疗方法，也没有抗病毒药物，因此很难控制其传播。牛冠状病毒病的治疗仍以收敛止泻、平衡电解质、补充体液、抗菌消炎等对症疗法和支持疗法为主。但最近越来越多研究发现，N蛋白是研发广谱冠状病毒抑制剂的潜在目标[46]，可能为BCoV 的防治提供了新方向。

对牛冠状病毒病最主要的预防措施是注射疫苗，其目的是获得特异性保护力。目前国外已有BCoV的商品化疫苗，如俄罗斯研制的预防新生犊牛腹泻的四联灭活疫苗[47]以及日本研制的BCoV灭活油佐剂疫苗等。美国辉瑞动物保健公司的Scour Guard 3（K）等灭活疫苗可以接种给妊娠后期的母牛以提高获得性免疫水平[48]，犊牛通过吮吸初乳摄入保护性抗体，以保护犊牛免受临床BCoV感染。也有一部分疫苗可直接作用于犊牛，通过口服的方式提升犊牛免疫力。Takamura 等[49]研发了一种由受感染细胞的可溶性细胞提取物与油基佐剂混合制成的疫苗，该疫苗抗体效价高，且尚未出现不良反应。Vega等[50]开发了一种通过口服免疫球蛋白Y（IgY）抗体产生被动免疫的新型疫苗可用于控制新生犊牛腹泻。此外还有一种鼻内疫苗可诱导即时的先天反应产生干扰素，进而迅速起到保护作用，犊牛可适时接种减毒的鼻内活疫苗。尽管我国也有学者进行过BCoV 疫苗的相关试验[51]，但尚无流通的国产商品化疫苗。目前对于BCoV疫苗的开发更偏向于安全、高效、成本更低的基因工程疫苗[52]。对于BRCoV相关疫苗的研究较少，也没有商品化疫苗的存在。自从2019年新冠病毒暴发后，由CoV 导致的呼吸道症状引起人们的高度重视，因此今后BCoV疫苗研究也可能更注重呼吸道与肠道多毒株联合疫苗的开发。

除了接种疫苗外，科学的饲养管理也能够在一定程度上预防牛冠状病毒病。如在养殖生产中使用次氯酸钠等消毒剂对牛舍、卧床等进行严格消毒，加强通风与打扫，定期更换垫料。此外，注重科学饲喂，提高机体抵抗力，也可降低牛冠状病毒病的发生概率。

6 展望

近年来，随着BCoV的相关研究不断深入，人们已对该病毒的基因结构、流行特性和致病机制等方面具有一定了解。但仍存在许多问题亟待解决:病毒基因组可能出现变异、重组事件，威胁人类安全；需要加强对某些蛋白功能、致病进程和免疫逃避等方面的研究；肠道型和呼吸道型BCoV的发病机制和因果关系还需继续研究。

目前市面流通的商品化疫苗存在免疫时间短、继发肌炎等缺点，故应加快新型疫苗的研发，如DNA 疫苗、亚单位疫苗。因此，加强BCoV的研究，完善相关疾病的防控，对保障畜牧业稳定发展具有重要意义。