类器官模型在子宫内膜癌治疗中的研究进展

么童童,刘伟龙,于文静,刘翠兰,石洪堂,刘志强

(滨州医学院附属医院 a.妇科;b.医学研究中心,滨州 256603)

子宫内膜癌是一种起源于子宫内膜上皮组织的恶性肿瘤,在我国发病率逐年上升,在欧洲西方国家居女性生殖系统恶性肿瘤首位,尽管子宫内膜癌治疗相关研究取得一定进展,但5年生存率未见显著改善。肿瘤是一种包括多种细胞类型的复杂生态系统,除肿瘤细胞外,还包括肿瘤相关基质细胞、微环境中的生长因子和代谢物等,它们对肿瘤细胞的生长、侵袭能力和药物反应具有深远的影响[1]。

传统的原代肿瘤细胞培养方法一直广泛用于子宫内膜恶性肿瘤相关研究,但由于缺乏肿瘤细胞与细胞之间和肿瘤细胞与细胞外基质之间相互作用的准确描述,且原代细胞株在传代过程中可能发生突变,难以再现子宫内膜恶性肿瘤复杂的异质性,因此这种二维(2d)细胞培养的结果对于临床试验的指示作用备受质疑。长期保存患者样本的另一种方法是将肿瘤碎片直接接种到免疫缺陷小鼠皮肤或其他部位,由此产生的人源异种移植(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)模型不仅保留了原始肿瘤的组织学特征,而且可以类似于临床环境的方式进行药敏测试。但由于固有的遗传差异,PDX不能完全重现人类免疫系统,不能模拟人类对癌变的特异性反应[2]。构建PDX模型费用高、耗时长,限制了其大规模应用。随着免疫治疗在肿瘤学中地位的提升,使用免疫缺陷小鼠构建的PDX模型无法重现人类特异性免疫反应,也无法在临床前试验中评估免疫治疗药物。子宫内膜癌研究仍缺乏切实可靠的组织模型,迫切需开发新型子宫内膜癌临床前模型,以改进药物研发和药物反应预测,从而解决不良反应率问题,提高癌症患者的生存率[3]。子宫内膜癌类器官的成功构建,使得女性生殖系统恶性肿瘤的治疗研究有了进一步突破。子宫内膜癌类器官(endometrial carcinoma-derived organoids)是一种多细胞三维(3d)组织结构,是体外特定3d细胞培养条件下,由子宫内膜原发恶性肿瘤细胞增殖形成的类器官临床前研究模型。类器官技术提供了更准确有效的肿瘤异质性表达组织,兼顾了肿瘤细胞和细胞外基质之间的相互作用,已成为桥接传统2d细胞培养和组织功能模型之间差距的潜在工具。由于3d系统支持健康上皮细胞的生长,因此类器官模型提供了其他肿瘤衍生模型系统所没有的优势——适合研究肿瘤发展的早期阶段[4]。此外,出于与动物模型相关的伦理考虑,类器官模型的实践更被视为是一种优势[5]。本文将就近几年来子宫内膜癌类器官的培养进展、类器官在子宫内膜癌发病机制以及药物筛选和精准医疗中的应用研究进行总结概述,进一步分析类器官在妇科肿瘤研究方面的局限性和发展前景。

1 子宫内膜癌类器官的培养进展

肿瘤类器官的细胞大部分来源于患者体内切除的肿瘤组织,利用Matrigel作为细胞外基质,构建更接近人体系统的肿瘤微环境。既往文献表明,类器官培养是一种可持续发展技术,在体外条件下允许基于Matrigel基质胶的培养物无限增殖细胞[6]。Jamaluddin等[7]以子宫内膜水凝胶优化了子宫内膜癌类器官的培养。

患者源性肿瘤类器官培养在食管癌、胃癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌等多种类型恶性肿瘤中已普遍应用[8-9],但在妇科肿瘤中的应用尚处于起步阶段,该培养方案在子宫内膜癌中的有效性仍有待确定。基于其他类型恶性肿瘤类器官培养方案,Maru等开发了一种有效的子宫内膜癌类器官培养方法——基质凝胶双层类器官培养[10],即先将癌细胞在固化的Matrigel上过夜孵育,次日再用Matrigel覆盖活细胞,子宫内膜癌类器官培养成功率为100%(4/4)。Boretto等[11]发现,培养子宫内膜癌类器官时,调整介质成分有利于长期增殖。Tumara等[12]使用离心后的癌性腹水作为浓缩的肿瘤细胞,在一定程度上保留了肿瘤细胞生长所需的微环境。Wu等[13]利用从癌灶中提取的癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)作为肿瘤基质的主要成分。

子宫内膜癌类器官培养过程中,Boretto等发现高级别类器官形态通常表现为致密、无可见管腔,原位植入小鼠可产生具有转移性、侵袭性强的原发性肿瘤,而低级别类器官通常表现为腺样形态,管腔清晰至中等,植入小鼠体内后形成符合子宫内膜癌进展的局部肿瘤[11]。这证明在类器官中,癌症分级与细胞异质性息息相关,子宫内膜癌类器官成功再现了原发肿瘤的组织学和异质性,保留了遗传和分子特征。子宫内膜癌的病理分型包括子宫内膜样癌、鳞状细胞癌、透明细胞癌、浆液性、黏液性、未分化型癌、癌肉瘤等[14],从高分化到低分化不同病理类型的子宫内膜癌中培养类器官[11],这对于生存率低、预后差的低分化子宫内膜癌至关重要。

2 类器官在子宫内膜癌发病机制中的研究

基因突变、组蛋白修饰和DNA甲基化是人类子宫内膜癌病理学分子改变的基础。已知的发生于子宫内膜癌中的常见突变基因有TP53、PTEN、PIK3CA、FBXW7和KRAS。根据临床、病理和分子特征,子宫内膜癌曾被分为两大类:I型雌激素依赖型子宫内膜样腺癌占80%,而II型肿瘤为非雌激素依赖型,包括浆液性癌、透明细胞癌和癌肉瘤[3]。Ⅰ型子宫内膜癌与PTEN、KRAS和PIK3CA突变有关,Ⅱ型子宫内膜癌通常显示TP53和HER-2扩增。诊断分期和组织学亚型是风险分类的主要决定因素,并指导辅助化疗和放疗的应用[15]。然而,子宫内膜癌往往是异质性的,可能同时包含Ⅰ型和Ⅱ型分子表型,从而限制了二元分类的应用。Kandoth等对373例子宫内膜癌的TCGA(癌症基因组图谱)数据进行分析,将子宫内膜癌基因组重新分类为四类:超突变、微卫星不稳定型、低拷贝数型、高拷贝数型。研究表明,25%的高级别子宫内膜样癌表现出类似于浆液性癌的分子表型[16],因此,分子分型使我们对肿瘤的异质性有了更清晰的认识,也更利于患者的个体化治疗。

Maru团队培养了15例卵巢癌类器官和6例子宫内膜癌类器官(其中5例病理类型为子宫内膜样癌,1例透明细胞癌)[17],对基因组分析发现TP53和PTEN基因的突变率从原发肿瘤中的70%增加到类器官中的近100%,表明基因的杂合性缺失和点突变是肿瘤中大多数癌细胞共有的原始突变,这些癌细胞在类器官中富集。相比之下,类器官中NF1基因的突变率较原发肿瘤从13%显著增加到95%,ARID1A基因的突变率从77%增加到81%,提示类器官培养期间存在肿瘤内的异质性和克隆选择。这项研究表明肿瘤衍生类器官保留了子宫内膜癌原始肿瘤的组织学和遗传学特征以及肿瘤内异质性,有助于深入了解妇科肿瘤的发病机制。

上述研究表明患者来源类器官培养物与原发肿瘤非常相似,子宫内膜癌类器官再现原发肿瘤的突变情况,并揭示疾病特异性基因表达,是体外肿瘤培养更有效的替代物。类器官有望成为广泛认可的女性生殖系统肿瘤研究模型。应用类器官可更好地探究妇科恶性肿瘤发生的分子机制,并更精准有效地治疗相关疾病。

3 类器官在药物筛选及个性化治疗中的应用

近年来,精准诊疗在子宫内膜癌领域进展迅速,高通量测序技术的发展加深了我们对子宫内膜癌发病机制和分子遗传特征的理解,分子分型检测、靶向治疗、免疫治疗的应用逐渐广泛[11],高通量测序可在广泛的癌症类型中生成大型数据库,利用这个不断扩展的数据库,我们能将复杂的肿瘤基因组学与治疗反应联系起来,并为个性化肿瘤学提供一个平台,提供对癌症基因组景观的见解,并确定新的潜在治疗靶点。

3.1 一线药物筛选 研究表明,类器官基本上保留了原发肿瘤的组织学和遗传学特征以及肿瘤内的异质性,因此可以确定治疗靶点,从而能正确评估药物毒性,确定杀灭肿瘤细胞的最佳剂量,同时减少对正常组织造成的损害[18]。子宫内膜癌的临床前药物筛选研究已使用子宫内膜癌类器官作为个性化医疗决策的工具来预测患者对治疗方案的反应结果。Girda等成功从子宫内膜肿瘤中培养出患者源性类器官,以进行药物敏感性试验[19],证明紫杉醇、TK1(酪氨酸激酶)抑制剂和STAT3(信号传导与转录激活因子)抑制剂对子宫内膜癌类器官的生长抑制作用。

此外,Chen等开发了大规模敏感性分析,用276种分子靶向化合物进行药物筛选[20],发现MI-136是一种针对menin-MLL复合物的有效子宫内膜癌抑制剂。首先对小鼠子宫内膜癌的肿瘤类器官进行无偏药物筛选,通过调节HIF通路确定MI-136是一种潜在的子宫内膜癌抑制剂,这是一种不同于治疗急性髓性白血病和前列腺癌的新机制。此外,该研究成功培养了4例源自患者的原发性子宫内膜癌类器官,发现MI-136显著抑制了类器官的生长。需进一步进行临床验证以关联发现。

Tamura等选择对子宫内膜癌标准治疗药物(紫杉醇和卡铂)具有较高耐药性的患者,建立相应类器官模型[12],验证了硼替佐米、卡非佐米、地那昔布和帕诺比诺司他对该类型肿瘤细胞生长和增殖具有显著抑制作用,这些抗癌药物可能是开发子宫内膜癌治疗新方案的候选药物。通过对原发肿瘤与类器官的基因表达谱分析,实验显示类器官的基因表达与原发肿瘤相似,再将类器官植入小鼠体内,异种移植物的基因表达谱与其原发肿瘤的基因表达谱也相似,证明类器官的特征概括了来源肿瘤组织的组织结构和表达谱,在免疫缺陷小鼠中移植后仍长期存在。因此类器官可被稳定且持续地用于临床条件下评估抗癌药物疗效,适合进行高通量药物筛选。

3.2 激素治疗 Girda等[19]发现,富维司坦(雌激素受体抑制剂)可抑制7种PDO培养物中的4种,这提示雌、孕激素在类器官形成和(或)生长中的重要性,可利用类器官增殖情况评估其对雌二醇或雌激素受体信号的依赖性。既往研究表明,子宫内膜上皮细胞的孕激素效应是由子宫内膜基质成分的旁分泌信号介导的,因此类器官微环境的发展对于雌/孕激素相关药物作用研究至关重要。

3.3 免疫治疗 个性化高通量药物筛选结合患者源性肿瘤样本的基因组分析,可为个体患者分层和确定有效的癌症治疗方案,并可能有助于发现预测抗癌药物药理作用的标记物。然而,来源于上皮细胞的肿瘤类器官可能无法识别靶向肿瘤-基质相互作用的药物,如肿瘤血管生长因子抑制剂。迄今为止,类器官模型未能完全捕获影响药物敏感性和耐药性的肿瘤-基质相互作用,这提示免疫肿瘤学的开发依赖于类器官的升级。

4 子宫内膜癌类器官的局限性

4.1 肿瘤微环境 类器官技术弥补了细胞系和异种移植模型的部分不足,但目前系统仍存在局限性。当前类器官技术的主要局限性之一是缺乏真实的体内微环境,肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)包括血管结构、细胞外基质和免疫细胞成分[21]。如Ⅰ型子宫内膜癌表现为高度雌激素依赖性,缺乏TME无法全面评价内分泌治疗、免疫治疗和抗血管生成药物疗效,因此保护原始患者特异性肿瘤和相关基质细胞的空间分布至关重要,这些相互作用影响肿瘤细胞增殖、分化、信号传导以及对化疗药物的耐药性。

4.2 异质性 肿瘤的一部分衍生的类器官与该特定肿瘤区域的基因组图谱正好匹配,并不代表整个肿瘤的基因组图谱。因此,体外肿瘤类器官检测应考虑肿瘤的空间异质性。目前类器官培养方案的主要限制是无法放弃动物源性基质凝胶或胶原蛋白。这些细胞外基质含有未知的细胞外成分,可能会意外地改变空间异质性,从而影响细胞行为。

国际上对类有机物的研究已将微流控技术和organon-a-chip技术应用于药物筛选[22],试图克服类器官培养的缺点。微流控细胞培养技术已产生了3D培养设备,这些设备现在适用于基于球体的类器官培养,并已被用于体外模拟器官微环境[23]。这项技术提供了精确控制微尺度以模拟生理条件和高通量方法的可能性,肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌等患者来源的类器官可在1～2周内生成和应用[24]。此外,芯片上器官[25]已被应用于类器官,以实现更接近体内组织状态的生理或病理模型系统,子宫内膜癌尚无应用该项技术的报道。研究人员致力于制定改进的长期培养方案,包括周围的肿瘤微环境,以更好地再现原发肿瘤。在未来几年中,罕见的阴道癌和外阴癌也需要类似的模型来改善生存率。

5 总结与展望

类器官保留了原始肿瘤的许多方面,包括组织学特征、突变谱和肿瘤内异质性,表现出强大的可扩展性,突破了原始活检数量的限制,从而允许基于个体化治疗决策的基因组和功能研究,创建临床前肿瘤模型和精准医疗的未来视角,用于了解女性生殖系统恶性肿瘤发生的机制、抗癌药物筛选和个性化药物,真正为个体化治疗和精准医疗服务。尽管类器官是具有广泛潜在应用的生物系统,但仍需要更多的努力来规范培养方案,并监测长期培养后的肿瘤异质性,这可能会直接影响药物筛选结果。类器官技术的未来进展预计将构建一个全面的癌症模型系统,该系统通过整合肿瘤实质细胞、血管和免疫细胞网络以及肿瘤微环境来重现生理条件。这个强大的模型将为生物标志物研究、药物筛选和更准确的治疗效果预测提供强有力的工具,并最终为人类健康事业服务。