青贮玉米有氧暴露过程中营养品质及细菌群落多样性

陈三冬， 巩海强， 尹国丽， 师尚礼

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室， 甘肃 兰州 730070)

青贮玉米(ZeamaysL.)易贮藏、易消化、成本低且营养价值高，适口性好，可以增加奶牛奶产量，提高肉牛日增重和养殖效益[1-2]，近年来青贮玉米的种植面积迅速扩大，截至2020年，我国青贮玉米种植面积已达100万公顷[3]，为解决冬春饲草匮乏的问题作出了巨大贡献。青贮玉米发酵完成后进入饲喂阶段，随着开窖、取料和饲喂的进行，青贮饲料与氧气产生接触，易使饲料发生二次发酵，发生有氧腐败[4]，有氧腐败是引发青贮饲料营养物质损失的重要原因[5]，此时好氧微生物大量繁殖，通过呼吸作用利用可溶性碳水化合物和蛋白质，导致可溶性碳水化合物等含量下降，同时产生热量导致温度上升引起发热变质[6]，使得青贮饲料品质下降。

不同种类的微生物对青贮饲料品质的影响也不相同[7]，其中乳酸菌在青贮发酵过程中产生大量的乳酸，防止了营养物质流失[8]，保证青贮营养品质，但乳酸菌含量过高会降低青贮饲料中抗真菌物质的含量，乳酸等同时也为可降解氮化合物的好氧细菌等微生物提供了繁殖底物，使青贮饲料在有氧暴露后容易发生霉变[9-10]。贾春旺等[11]通过对不同比例青稞秸秆青贮饲料的研究发现好氧细菌利用水溶性碳水化合物和蛋白质，造成青贮饲料品质下降。王旭哲等人[12]研究发现，未经处理的青贮玉米在开窖后，有氧稳定的时间为131.71 h。

青贮饲料有氧暴露伴随着青贮品质的下降，使青贮饲料的利用有了时间限制，防止青贮饲料二次发酵，是青贮饲料在利用过程中的重中之重。由此，了解研究青贮玉米品质有氧暴露后细菌微生物菌群构成及变化特征，掌握有氧暴露后的稳定的时间可有效预防有氧腐败。目前，有关全株玉米青贮饲料在有氧暴露条件下，微生物对青贮玉米营养品质影响的研究报道较少。鉴于此，本试验旨在研究青贮玉米中有氧暴露后营养品质的变化规律及其与细菌群落多样性变化间相关性，通过对其养分含量、细菌群落结构和细菌多样性指标进行综合分析，明确有氧暴露后青贮玉米细菌群落结构与营养成分的相关性，得到营养成分发生明显变化的转折点，为青贮饲料的安全饲喂和防止青贮饲料有氧腐败提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验地位于甘肃省兰州市西固区达家台，地处北纬39.96，东经116.40，年平均温度8.50℃，年平均日照达2 780 h，≥ 10℃的年有效积温2 700～3 300℃，年平均降水量327.70 mm。

供试玉米品种：粮饲兼用型，‘和盛5288’玉米(ZeamaysL. ‘Hesheng 5288’)。

试验小区面积为180 m2，播种时采用精量机播，行距65 cm，种植密度600 000株·hm-2，于蜡熟期收割，留茬高度15 cm，晾晒至水分含量65%左右，揉丝机切碎，混合均匀后装入铝箔真空袋中，每袋装500 g，制作27袋，使用真空机抽真空状态并封口，自然发酵35 d后，同一时间将青贮袋全部打开。试验以有氧暴露0 h，1 h，8 h，24 h，36 h，48 h，72 h，96 h，120 h为9个处理，分别记为K0h，K1h，K8h，K24h，K36h，K48h，K72h，K96h，K120h各处理3次重复，随机选取三袋，在超净工作台中每袋称取20 g青贮饲料，放入无菌水中震荡30 min，震荡后的上清液过0.22 μm滤膜，将滤膜保存在—80℃冰箱中，用于总DNA提取。袋中剩余青贮玉米放置105℃烘箱，烘干后用粉碎机粉碎，过22目筛，进行营养品质的测定。

1.2 测定指标和方法

参照AOAC[13]常规方法测定粗蛋白(Crude protein，CP)、干物质(Dry matter，DM)、钙(Calcium，Ca)、磷(Phosphorus，P)和粗灰分(Coarse ash)含量，采用范式(Van Soest)洗涤纤维测定方法来测定中性洗涤纤维(Neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(Acid detergent fiber，ADF)含量；采用蒽酮比色法来测定可溶性糖(Water solublecarbohydrate，WSC)含量。

青贮玉米总DNA提取及细菌16S rDNA：基因扩增使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒完成核酸的提取，使用酶标仪(基因有限公司Gene Company Limited，型号synergy HTX)检测提取核酸的浓度，以该检测浓度下DNA浓度为模板，对细菌16Sr DNA V4区引物338F和806R进行PCR扩增，使用浓度1.80%的琼脂糖对PCR产物进行电泳检测(北京博美富鑫科技有限公司)后建立检测文库。通过Qsep-400方法对文库进行质检合格后使用Illumina Novaseq6000进行上机测序。下机后使用UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效序列(Effective Reads)。

1.3 数据分析

用Excel 2016进行数据整理，用SPSS 20.00软件对数据进行差异性分析，R软件(2.15.3)绘制稀释曲线，QIIME2软件对样品Alpha多样性指数进行分析，Origin绘制相关性热图。

2 结果与分析

2.1 青贮玉米有氧暴露过程中营养品质的变化

随着有氧暴露时间延长(表1)，蛋白质含量总体呈下降趋势，K0h的粗蛋白含量最高，有氧暴露1 h后粗蛋白显著降低(P<0.05)，K0h至K1h蛋白质含量的降幅为4.91%，K0h至K24h和K96h蛋白质含量的降幅为6.12%，7.67%；中性洗涤纤维的含量随有氧暴露时间的增加显著上升(P<0.05)，有氧暴露120h中性洗涤纤维含量增幅为31.88%，且K0h至K1h内中性洗涤纤维含量增幅最大，增幅为8.90%；K0h至K120h酸性洗涤纤维含量增幅为31.96%，且K72h至K96h内酸性洗涤纤维含量增幅最大，增加了7.60%；可溶性糖含量随有氧暴露时间的延长显著降低(P<0.05)，K0h至K8h和K120h可溶性糖含量降幅分别是8.12%和33.20%，有氧暴露48h之前可溶性糖含量下降速度较慢，有氧暴露48 h后可溶性糖含量快速下降，K0h至K8h与有氧暴露48h可溶性糖含量降幅分别是8.12%和10.90%；干物质含量随有氧暴露时间呈现下降趋势，K120h显著小于K0h(P<0.05)，有氧暴露120 h干物质含量降幅为6.70%，干物质含量在有氧暴露48h后开始快速下降。有氧暴露后磷和钙含量在不同暴露时间无显著差异；K96h的灰分含量显著高于其他处理(P<0.05)。

表1 有氧暴露过程中青贮玉米营养品质的变化Table 1 Effects of aerobic exposure of different time on the nutritional quality of silage maize

2.2 青贮玉米有氧暴露过程中细菌群落丰度与Alpha多样性分析

高通量测序结果可得(表2)，从有氧暴露0 h到120 h时间段内的有效序列在39 740和66 229之间波动，OTUs的数目分别是542，598，560，609，563，562，544，544和528，图1样品稀释曲线都趋于平缓，结合覆盖度均在99%以上，表明本试验测序数据的合理性与真实性。Chao1指数和ACE代表物种丰富度，Chao1指数和ACE指数在K36 h时最大，其中Chao1指数和ACE指数均在K36h下显著高于K0h(P<0.05)；覆盖度在K0h下显著高于K36h(P<0.05)；Shannon-wiener能同时反映丰富度和均匀度，Shannon-wiener指数差在K0h时最高，在有氧暴露1 h内大幅下降，说明K0h时细菌多样性最高，有氧暴露1h内细菌多样性大幅降低。由图2可知由，各时间点共有OTUs数目为371个，其中0 h，1 h，8 h，24 h，36 h，48 h，72 h，96 h，120 h所特有的OTUs数目分别是3，1，1，3，2，3，2，2，2个。

表2 样品序列数统计、丰富度与多样性指数Table 2 Sample sequence numbers statistics,richness and diversity index

图1 样品稀释曲线Fig.1 Rarefaction curves for samples

图2 样品花瓣图Fig.2 Flower diagrams of samples

2.3 青贮玉米有氧暴露过程中细菌群落分布

2.3.1门水平的细菌群落变化 由图3可知，有氧暴露不同时间下玉米青贮饲料细菌群落相对丰度前十的细菌门分别为：厚壁菌门(Firmicutes)(30.19%～52.34%)，疣微菌门(Verrucomicrobia)(0.39%～1.65%)，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)(1.15%～3.54%)，变形菌门(Proteobacteria)(31.3%～42.05%)，棒状杆菌门(Rokubacteria)(0.51%～1.27%)，酸杆菌门(Acidobacteria)(3.72%～11.87%)，蓝藻门(Cyanobacteria)(0.28%～1.39%)，放线菌门(Actinobacteria)(4.58%～10.56%)，拟杆菌门(Bacteroidetes)(1.96%～4.22%)，绿弯菌门(Chloroflexi)(1.14%～2.53%)，占细菌总数的97.61%～99.22%，厚壁菌门和变形菌门为该分类水平下优势细菌。除绿弯菌门和棒状杆菌门外，其余8个优势菌门相对丰度在不同有氧暴露时间下存在着一定的差异。厚壁菌门相对丰度在K0h下显著高于K36h，K48h和K120h(P<0.05)，与其他时间差异不明显；变形菌门相对丰度在K0h下显著小于K72h(P<0.05)，与其他时间差异不显著；酸杆菌门相对丰度在K0h下显著低于K48h(P<0.05)，与其他时间差异不显著；放线菌门相对丰度在K0h下显著低于K120h(P<0.05)，与其他时间差异不显著；拟杆菌门相对丰度在K96h显著高于K72h(P<0.05)，与K0h及其他时间差异不显著，芽单胞菌门相对丰度在K0h显著低于K48h(P<0.05)，与其他时间差异不显著；疣微菌门相对丰度在K36h下显著高于K0h，K1h，K8h，K72h(P<0.05)，与其他时间差异不显著；蓝细菌门相对丰度在K8h下显著高于K0h及其他时间；厚壁菌门与放线菌门是有氧暴露不同时间下的优势菌，厚壁菌门在K0h，K1h，K8h，K24h，K36h，K96h时为优势菌门，放线菌门在K48h，K72h，K120h时为优势菌门，在有氧暴露36 h内厚壁菌门相对丰度呈下降趋势，变形菌门相对丰度呈先升高后下降的趋势，在整个有氧暴露过程中厚壁菌门相对丰度的升高时变形菌门相对丰度降低，两者可能存在竞争关系。

2.3.2属水平的细菌群落变化 由图4可知，不同有氧暴露时间下玉米青贮饲料细菌群落相对丰度前十的细菌属分别为：乳酸菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae、魏斯氏菌属(Weissella)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、RB41和沙雷式菌属(Serratia)，占细菌总数的42.58%～70.20%，在整个有氧暴露过程中各细菌属相对丰度在不同暴露时间下存在一定的差异，乳酸菌相对丰度在有氧暴露过程占比最高。乳酸菌属相对丰度呈先下降后上升的趋势，魏斯氏菌属变化趋势与之恰好相反，两个属之间可能存在竞争关系，乳酸菌属相对丰度在有氧暴露0 h下显著高于其他时间(P<0.05)，明串珠菌属相对丰度在K120h显著小于K0h以及其他时间(P<0.05)；除K96h外，uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae相对丰度在K1h和K8h下显著高于K36h(P<0.05)，与K0h差异不显著，魏斯氏菌属相对丰度在K72h下显著高于K24h，K48h，K120h(P<0.05)与K0h差异不显著；寡养单胞菌属相对丰度在K0h下显著高于K120h(P<0.05)，与其他时间差异不显著；醋酸杆菌属相对丰度在K48h下显著高于K0h，K24h和K72h(P<0.05)，与其他处理差异不显著；uncultured_bacterium_c_Subgroup_6相对丰度在K72h下差异显著高于K0h及其他时间(P<0.05)，鞘脂单胞菌属相对丰度在K48h下显著高于K0h和K72h(P<0.05)，与其他处理差异不显著，RB41相对丰度在K36h下显著高于K0h(P<0.05)，与其他处理差异不显著，沙雷式菌属相对丰度在K120h下显著小于K0h，K1h和K96h(P<0.05)，与其他处理差异不显著。

图3 门分类水平下的细菌群落相对丰度Fig.3 Relative abundance of bacterial community at phylum level

图4 属分类水平下的细菌群落相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at genus level

2.4 青贮玉米有氧暴露过程中细菌群落多样性与营养品质的相关性

在有整个氧暴露过程中青贮玉米中厚壁菌门相对丰度与可溶性糖和蛋白质含量呈极显著正相关关系，与中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量呈极显著负相关关系；变形菌门相对丰度与磷含量呈极显著正相关关系；拟杆菌门相对丰度与钙含量呈显著正相关关系，绿弯菌门相对丰度与中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量呈极显著正相关关系，与可溶性糖含量呈极显著负相关关系；蓝藻门相对丰度与灰分含量成极显著负相关关系。

图5 青贮玉米有氧暴露过程中细菌群落与营养品质相关性热图Fig.5 Heat map of correlation between bacteria community and nutritional quality during aerobic exposure of silage maize注：图5中“FRI”表示厚壁菌门；“PRO”表示变形菌门；“ACI”表示酸杆菌门；“ACT”表示放线菌门；“BAC”表示拟杆菌门；“GEM”表示芽单胞菌门；“CHL”表示绿弯菌门；“VER”表示疣微菌门；“ROK”表示棒状杆菌门；“CYA”表示蓝藻门Note:In figure 5 “FRI” means Firmicutes；“PRO” means Proteobacteria；“ACI” means Acidobacteria；“ACT” means Actinobacteria；“BAC” means Bacteroidetes；“GEM” means Gemmatimonadetes；“CHL” means Chloroflexi；“VER” means Verrucomicrobia；“ROK” means Rokubacte

3 讨论

3.1 有氧暴露时间对青贮玉米营养品质的影响

本试验中随用于暴露时间延长蛋白质、可溶性糖和干物质含量升高，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量降低。有氧暴露后空气通过青贮面渗透至青贮饲料中[14]，随青贮饲料中氧气浓度的增加植物蛋白酶的活性升高[15]，同时厚壁菌门的大部分细菌可以分解蛋白质[16-17]，两者导致蛋白质含量降低；在有氧暴露初期，好氧细菌开始大量繁殖，将可溶性糖和蛋白质等转化为二氧化碳，这种以气体形式损失的干物质含量增加了中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量的比例[18]，同时降解纤维素的厚壁菌门相对丰度降低，可能具有纤维素分解能力的酸杆菌含量较少[19-20]，减缓了纤维素的分解；可溶性糖含量下降可能是好氧微生物和乳酸菌将可溶性糖分解成水、CO2和热量[21]所致；可溶性糖等被好氧细菌降解和利用导致干物质减少，这与Queiroz等[22]研究结果相一致。有氧暴露1 h内粗蛋白和可溶性糖含量大幅度下降，理论上应在有氧暴露1 h内完成饲喂，这样能够有效防止营养品质的流失和好氧细菌大量繁殖，但在实践生产中，1 h内全部完成利用的难度大，有氧暴露8 h内在满足了蛋白质和干物质含量高的同时，也要保证可溶性糖含量高，是最适的饲喂时间。

3.2 有氧暴露后细菌及其青贮玉米营养品质的相互影响

青贮原料的营养成分会影响青贮过程中微生物菌群的多样性[23]，同样微生物多样性也与青贮品质有一定的相关性[24]。Shannon-wiener指数差在K0h与K1h间最高，此时青贮饲料中细菌多样性下降，有学者研究发现优势菌属越丰富，细菌群落的多样性越少[25]，同时有氧暴露使厌氧细菌和兼性厌氧菌生长与繁殖受阻，导致细菌多样性在短时间内下降。K1h至K36h随有氧暴露时间延长好氧细菌的滋生，细菌多样性逐渐增加，在K36h时物种丰富度最高。乳酸菌属在K0h下相对丰度最高，乳酸菌是典型的厌氧微生物，在厌氧情况下才可进行正常的生命活动[26]，有氧暴露后可能抑制了部分乳酸菌的繁殖。明串珠菌属和寡养单胞菌属的相对丰度均在K120h显著小于K0h，明串珠菌属是兼性厌氧细菌，具有抑菌特性[27]，寡养单胞菌属为好氧细菌，有氧暴露后氧气充足，导致明串珠菌属相对丰度降低，寡养单胞菌属相对丰度降低可能是明串珠菌属的抑菌作用导致。

本试验中绿弯菌门相对丰度与中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量呈极显著正相关关系，有氧暴露后绿弯菌门相对丰度增加，研究发现部分绿弯菌门细菌具有捕食作用，能分泌大量不同种类的水解酶对宿主细菌消化吸收[28-29]，可能导致分解纤维素的部分细菌死亡，对中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解减慢；变形菌门在水体脱氮除磷过程中起重要作用[30]，强茹茹等[31]对解磷菌剂的研究表明在不同试验处理下，变形菌门的相对丰度均高于其他细菌门，有氧暴露后变形菌门相对丰度与青贮饲料中的磷含量呈正相关关系，这进一步验证了变形菌门对磷有降解作用。

4 结论

本研究表明，青贮玉米在有氧暴露过程中可溶性糖、粗蛋白和干物质含量降低；有氧暴露1小时后蛋白质含量显著下降，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著升高；有氧暴露8 h前可溶性糖和干物质含量变化不明显；灰分、钙和磷含量随有氧暴露时间变化不明显。

有氧暴露36 h后细菌多样性最高；优势细菌门为厚壁菌门和放线菌门，优势菌属为乳酸菌属；厚壁菌门、变形菌门和酸杆菌门对青贮玉米营养品质有显著影响。与生产实践相结合，为防止营养成分大量流失，青贮玉米应在有氧暴露8 h内完成饲喂。