过表达miR-144-3p减轻Ang Ⅱ诱导的HUVEC损伤

叶远征，付晓晓，马晓芸，范 平*

新疆医科大学第一附属医院 1.心功能科；2.省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室；4.干部特诊区，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830000；3.乌鲁木齐市中医医院 药学部，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830000

高血压(hypertension)是引起心脑血管疾病的重要危险因素，也是慢性肾功能衰竭的主要原因之一。众所周知，高血压的病理生理学是多因素的，包括血流动力学应激反应、内皮细胞失调、血管平滑肌功能障碍、活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加、交感神经系统的激活以及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的激活等[1]。非编码RNA已经被越来越多的研究证实在多种细胞与疾病的发生发展过程中发挥了重要的调控作用。MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源性非编码RNA，它能够通过多种作用机制对血管内皮细胞的结构和功能进行调节。miR-144-3p在多种疾病的发生发展中发挥了重要作用[2-4]。然而，miR-144-3p在高血压中的作用尚未见文献报到。本研究前期已证实miR-144-3p在高血压患者中低表达，提示其可能在高血压的发生发展过程中也发挥了重要作用。本研究的目的在于探讨其对血管内皮细胞生物学功能的影响，为高血压病的诊治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人脐静脉内皮细胞系(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)(中国科学院细胞库)；DMEM培养基、Opti-MEM 培养基和胎牛血清(FBS)(均Gibco公司)；血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)(Sigma-Aldrich公司)；ROS试剂盒和TUNEL试剂盒(南京研拓生物科技有限公司)；Lipofectamine 3000转染试剂盒(Invitrogen公司)；实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(TaKaRa公司)；EdU试剂盒、annexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Keygen公司)；引物、miR-144-3p 模拟物(mimic)、miR-144-3p 阴性对照(NC)(由上海吉玛公司设计合成)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测miR-144-3p的表达：利用miRNA提取试剂盒提取细胞总RNA，按照反转录试剂盒反转录cDNA，按照试剂盒说明书进行RT-qPCR扩增。反应体系包括：上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，加dd H2O至总体积20 μL。反应条件：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 30 s，57 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循环40次。分析熔解曲线，反应结束后计算Ct值。miR-144-3p上游引物序列:5′-GGCCGGCGTACAGTATAGATGA-3′，下游引物序列:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6上游引物序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6为内参，采用2-△△Ct法计算miR-144-3p相对表达量。

1.2.2 细胞的分组： 使用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 g/mL链霉素的DMEM完全培养基；培养条件均为37 ℃恒温及5% CO2浓度培养箱。构建AngⅡ诱导的HUVECs损伤模型：待细胞汇合后，加入2 mL含血清不含抗生素的DMEM培养基，然后加入200 μL 10 nmol/L的Ang Ⅱ溶液诱导。置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h，用于后续实验。miR-144-3p mimic、miR-144-3p NC根据说明书，使用 Lipofectamine 3000进行转染。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：将转染细胞调至(6～8)× 104个/mL，取100 μL接种于含有10% DMEM培养液的96孔板中，分别取第1、2、3、4、5天样品进行细胞增殖检测。操作方法：检测前4 h每孔加入20 μL MTT 贮存液，培养4 h后，弃去孔中培养液，各加150 μL DMSO，振荡溶解，用酶标仪检测(490 nm)各孔吸光度值，每组实验重复5次。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞侵袭：细胞转染48 h 后，在无血清培养基中调整细胞浓度至1×105个/mL，吹匀后在Transwell小室的上室加入200 μL细胞悬液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培养基，置于5% CO2、37 ℃培养箱中孵育24 h后，取出小室，将Transwell小室基底膜完整切除，用无菌棉签擦去上室内细胞，多聚甲醛固定15 min，苏木精染色10 min，显微镜下随机取5个视野计数侵袭细胞数目，取平均值。

1.2.5 流式细胞测量术检测细胞凋亡：将细胞制成单细胞悬液，冰PBS洗涤2次。采用annexin V-FITC/PI双染，避光孵育10 min，流式细胞仪上机检测各组细胞凋亡率。

1.2.6 流式细胞测量术检测细胞内ROS活性：用冰PBS洗涤细胞，随后与1 mmol/L DCHF-DA在37 ℃下避光温育30 min。然后将细胞用胰蛋白酶消化并再次用PBS洗涤并重悬于无血清培养基中(1×106个/ mL)，最后用于流式细胞测定细胞内ROS活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-144-3p的转染效率

与对照组相比，模型组HUVECs中miR-144-3p的表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，转染miR-144-3p模拟物组的细胞中miR-144-3p的表达水平显著升高(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.2 miR-144-3p对HUVECs增殖的影响

与对照组相比，模型组细胞的增殖能力显著降低(图2A)。而与模型组相比，转染miR-144-3p模拟物组的细胞增殖能力明显增强(P<0.05)(图2B)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.3 miR-144-3p对HUVECs凋亡的影响

与对照组相比，模型组HUVECs，凋亡率显著升高(P<0.05)。而与模型组相比，转染miR-144-3p模拟物组的细胞凋亡率明显下降(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.4 miR-144-3p对HUVECs侵袭的影响

与对照组相比，模型组HUVECs侵袭能力明显下降(P<0.05)。而与模型组相比，转染miR-144-3p模拟物组的细胞侵袭能力明显增强(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

2.5 miR-144-3p对HUVECs内ROS活性的影响

与对照组相比，模型组细胞内ROS活性显著升高(P<0.05)。而与模型组相比，转染miR-144-3p模拟物组细胞内ROS活性明显下降(P<0.05)(图5)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with Ang Ⅱ

3 讨论

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在20个核苷酸左右的内源性小非编码RNA，参与调控细胞的增殖、凋亡、侵袭、黏附等多种生物学行为，在众多疾病的发生发展过程中发挥了重要的作用[5-6]。miRNAs一方面能够从上游接受转录因子和(或)其他非编码RNA的调控，另一方面，能够通过吸附能力调节下游靶基因的表达，其相互作用可以描绘出复杂的调控网络，从而影响细胞和疾病的发生发展[7]。据报道，miR-122、 miR-96-5p、 miR-181b、miR-27a等通过靶向不同的基因参与调节血管平滑肌细胞的增殖[8-11]。miR-144-3p是近年来新发现的一个miRNA分子，研究表明其在多种肿瘤中表达下调，且在不同肿瘤中通过多种作用机制双向调控肿瘤细胞增殖、侵袭、放射性治疗和化学药物治疗的敏感性等[12-14]。然而，miR-144-3p在高血压中的表达和作用尚无文献报道。

前期研究中，通过收集高血压患者和健康人外周血进行microRNA芯片高通量筛选，发现了一系列差异表达的microRNAs。结果显示miR-144-3p在新疆维吾尔人群原发性高血压病人中显著低表达，故选取miR-144-3p作为研究对象。本实验结果显示，与对照组相比，Ang Ⅱ诱导的模型组细胞增殖和侵袭能力显著下降，而凋亡率和细胞内ROS水平显著上升；而过表达miR-144-3p后，细胞的增殖能力和侵袭能力得到了一定程度的恢复，细胞凋亡率和细胞内ROS水平显著下降。上述研究提示其可能通过调节血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞损伤而参与高血压的发生发展。

内皮细胞损伤是心血管疾病发生的关键因素，血管内皮功能也是心血管疾病的研究热点之一。越来越多的证据表明，血管平滑肌细胞的异常增殖对于心血管疾病的发展和发病机制至关重要，包括动脉粥样硬化、高血压、再狭窄和腹主动脉瘤的形成[15]。肾素-血管紧张素系统(RAS)已被证实有助于血管重塑的发展。血管紧张素(Ang Ⅱ)是一种多功能激素，对血管紧张素Ⅱ受体1型或血管紧张素Ⅱ受体2型的血管稳态至关重要。尽管一些研究表明，血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖有助于血管重塑，但这一过程的分子机制仍有待阐明。

综上所述，本研究发现miR-144-3p能够在一定程度逆转血管紧张素Ⅱ诱导的人脐静脉内皮细胞损伤。本研究为进一步探索miR-144-3p在高血压中的作用机制奠定了一定理论基础。