ASH2L在幽门螺旋杆菌感染的人胃癌细胞系中的表达及临床意义

谢晓婷，张 雷*，张 莉*，董 凤，刘 颖,2，李光华，杨 兴

1.大理大学 病原与媒介生物研究所 云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室, 云南 大理 671000；2.吉林大学第一医院 二部检验科，吉林 长春 130000

胃癌(gastric carcinoma, GC)是全球范围内的主要健康问题之一，2020年全球GC新增病例超过100万例，其病死率在恶性肿瘤中排第四位[1]。幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori, Hp)感染导致的慢性胃炎和消化性溃疡，是胃癌发展的最大危险因素[2]。世界上已经有超过一半的人口感染了Hp，在中国约有5.89亿人感染Hp[3]。据世界卫生组织2018年统计，81.2万例新的胃恶性肿瘤病例可归因于Hp感染，其中胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)占90%[4]。研究表明，Hp感染可导致NF-κB信号通路的激活，引起持续性的炎性反应和免疫反应，进而促进胃癌的发生[5]。但是，Hp感染致病的确切机制迄今仍不清楚。已有研究表明果蝇蛋白Ash2的类似物(absent，small or homeotic2-like protein, ASH2L)作为H3K4甲基转移酶复合体的核心成分对于组蛋白H3K4的甲基化起到非常重要的作用[6]，且ASH2L在许多肿瘤细胞系中高表达[7]。本研究利用多种生物信息学软件对癌数据库中的数据进行挖掘，以分析ASH2L在多种肿瘤中的表达水平、与胃癌患者临床病理特征的关系及其预后；并在实验研究中用Hp分别感染GES人胃上皮细胞和两种人胃腺癌上皮细胞(SGC-7901、AGS)，以分析在人胃上皮细胞中Hp感染因素对ASH2L表达水平的影响，初步探讨ASH2L在Hp感染所致胃癌中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及菌株：健康人胃黏膜上皮细胞系GES、中分化人胃腺癌细胞系SGC-7901、低分化人胃腺癌细胞系AGS(中国科学院昆明细胞库)；Hp标准菌株(ATCC43504)(美国菌种保存中心)。

1.1.2 试剂：DMEM 培养基(Gibco公司)；特级胎牛血清(QuaCell公司)；胰蛋白酶、高效RIPA组织/细胞快速裂解液、青霉素及链霉素(北京索莱宝科技有限公司)；Hp培养所需混合气体(85% N2、10% CO2、5% O2)(MESSER公司)；胰蛋白大豆琼脂(BD公司)；ASH2L Rabbit mAb(Cell Signaling Technology公司)；羊抗兔IGg-HRP(Abcam公司)；FastKing cDNA 第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞生物科技股份有限公司)；BCA蛋白质定量/浓度测定试剂盒(美仑生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基于癌数据库的ASH2L生物信息学分析

1.2.1.1 ASH2L在不同肿瘤组织中的表达差异：TIMER是一个资源全面的肿瘤免疫在线研究工具，包括32种癌类型的10 897个样本[8]。本研究利用TIMER2.0(http://timer.comp-genomics.org/)工具在线分析ASH2L 在不同肿瘤中的表达差异。

1.2.1.2 ASH2L在胃腺癌组织中的表达及其与胃腺癌患者临床病理特征的相关性:UALCAN平台(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)收录了TCGA 数据库中3种水平的RNA-Seq和31种癌类型的临床数据[9]，可以分析肿瘤和正常样本之间以及基于单个癌分期、肿瘤分级或其他临床病理特征中基因的相对表达。在该平台的TCGA癌数据库中筛选ASH2L在STAD中的表达情况，分析ASH2L与胃腺癌患者的年龄、性别、种族、病理分级、肿瘤分期之间的关系。

1.2.1.3 ASH2L的表达对胃癌患者生存的影响:Kaplan-Meier plotter工具(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)可评估乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等21种肿瘤类型的样本中基因或蛋白质的表达与生存率之间的相关性。利用该工具从mRNA水平分析ASH2L基因对GC患者的总体生存率(overall survival，OS)和后进展生存期(post progression survival，PPS)的影响。

1.2.2 Hp感染人胃上皮细胞系对ASH2L表达的影响

1.2.2.1 人胃上皮细胞和Hp的培养：将1.5×105个/mL的GES、SGC-7901和AGS三种细胞按每孔2 mL铺入6孔板中，5% CO2、37 ℃培养24 h后，分别取其中1孔细胞进行计数，以确定细胞数量。几种细胞培养基的成分均为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。Hp菌株在微需氧条件下(5% O2、10% CO2和85% N2)于37 ℃在含10%新生牛血清的胰蛋白大豆琼脂平板上培养48 h，按A600=1×CFU/mL测定活菌数量[10]。

1.2.2.2 Hp感染人胃上皮细胞系：经本实验室前期大量实验摸索得到的最佳感染条件为感染复数(MOI=200)，感染时间=60 min，按MOI为200，将1 mL的菌悬液分别加入上述培养24 h的3种细胞中，放入37 ℃温箱中感染60 min，收集未感染和感染后的细胞样品，分别制备总RNA样品和蛋白质样品，用于检测ASH2L的表达。

1.2.2.3 Hp感染前后细胞中ASH2L表达量的测定：1)RT-qPCR检测ASH2L的表达：分别提取Hp未感染组与Hp感染组的GES、SGC-7901和AGS细胞系的总RNA，将总RNA样品反转录成cDNA。ASH2L上游引物：5′-AGAATGGCCGACAGTTGGG-3′，下游引物：5′-CCTTCAAGTTTGCTTGCTTCC-3′；GADPH(内参)上游引物： 5′-GGAGCGAGATCC CTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATA CTTCTCATGG-3′。2)Western blot检测ASH2L的表达：细胞样品加入裂解液裂解，得到蛋白质样本,将蛋白质样品经BCA法测浓度，将得到的免疫印迹条带经ImageJ进行吸光度值分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基于癌数据库的ASH2L生物信息学分析结果

2.1.1 ASH2L在肿瘤组织及正常组织中的差异表达：利用 TIMER2.0工具在线分析 ASH2L在不同肿瘤中的表达差异，结果表明ASH2L在15种肿瘤中的表达存在差异，与正常胃组织相比，ASH2L在胃腺癌组织中高表达(P<0.05)(图1)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with normal gastric tissue

2.1.2 ASH2L在胃腺癌中的表达及其与胃腺癌患者临床病理特征的关系：ASH2L在胃腺癌组织中的表达水平明显高于正常胃组织(P<0.05)(图2A)。亚洲人和白种人的ASH2L表达量明显高于正常水平，且非裔美国人中ASH2L的表达量明显低于白种人(P<0.05)(图2B)；在41～60岁和61～80岁年龄组胃腺癌患者中ASH2L的表达量明显高于正常水平，且21～40岁年龄组胃腺癌患者中的ASH2L明显高于61～80岁和81～100岁年龄组(P<0.05)(图2C)；ASH2L的表达量与男女性别无关(图2D)，在3个病理分级中ASH2L的表达量均高于健康人(P<0.05)(图2E)，在肿瘤前3个分期阶段ASH2L的表达量均较健康人高(P<0.05)(图2F)。

A.expression of ASH2L in STAD based on sample types; B.expression of ASH2L in STAD based on patient’s race; C.expression of ASH2L in STAD based on patient’s age; D.expression of ASH2L in STAD based on patient’s gender; E.expression of ASH2L in STAD based on tumor grade; F.expression of ASH2L in STAD based on indivigual cancer

2.1.3 ASH2L的表达水平对胃癌患者OS和PPS的影响：高表达水平的ASH2L在胃癌中预示更差的总生存期(P=0.17)和更差的后进展生存期(P<0.05)(图3)。

A.effect of ASH2L gene on the OS of patients with gastric adenocarcinoma；B.effect of ASH2L gene on PPS in patients with gastric adenocarcinoma

2.2 Hp感染前后胃上皮细胞系中ASH2L的表达

与Hp未感染组相比，Hp感染组的GES、SGC-7901、AGS细胞中ASH2L的mRNA表达量显著上调(P<0.05)(图4)。

A.ASH2L mRNA expression in GES cells; B.ASH2L mRNA expression in SGC-7901 cells; C.ASH2L mRNA expression in AGS cells; *P<0.05 compared with cell lines without Hp infection factor

Hp未感染组相比Hp感染组的细胞系中ASH2L蛋白的表达量显著上调(P<0.05)(图5)。

A.expression of ASH2L protein in GES cells; B.expression of ASH2L protein in SGC-7901 cells; C.expression of ASH2L protein in AGS cells; *P<0.05 compared with cell lines without Hp infection factor

3 讨论

胃癌是全球第五大常见的癌以及第四大癌死亡原因[1]。除了亚硝酸盐和咸食等饮食因素外，Hp感染也是诱发胃癌的主要原因，尽管胃癌的治疗技术也正在迅速发展，以对抗这种具有挑战性的疾病[11]，但Hp感染诱发胃癌的确切机制尚未明确。

本研究通过UALCAN数据库分析发现在胃腺癌组织中ASH2L呈现高表达的现象，这与目前ASH2L在其他多种肿瘤(如食管癌、子宫内膜癌和睾丸癌)中高表达的研究结果一致[12-13]。目前的研究表明ASH2L的高表达与子宫内膜癌的预后不良相关[12]，而低水平的ASH2L与急性髓系白血病总生存率增加相关[14]，这些研究结果与本研究中ASH2L的高表达可缩短胃癌患者的总生存期和后进展生存期的结论一致。因此，ASH2L有可能作为临床诊断、预后和治疗的靶标。

尽管Hp感染诱发胃癌的具体机制尚未揭示，但是目前一致认为NF-κB信号通路的激活是Hp感染致胃溃疡、胃癌的重要原因。ASH2L作为一种具有甲基转移酶活力的蛋白质，对于H3K4的甲基化起到非常重要的作用，阻断ASH2L会下调H3K4Me3，从而负调控基因转录[15]。过表达ASH2L导致肿瘤增殖，而基因沉默ASH2L则抑制肿瘤的发生发展，因此ASH2L被认为是一种癌蛋白[7]。在子宫内膜癌的研究中表明，ASH2L通过改变组蛋白H3K4me3和H3K27me3的水平，以促进雌激素受体α诱导的靶基因PAX2的激活，进而促进子宫内膜癌的进展[12]。而HEK-293、HT29和U2OS等细胞在外界因子的刺激下，P65的多个不同的赖氨酸残基会被甲基化。在本研究中发现Hp感染后，胃上皮细胞出现ASH2L表达水平显著增高。因此，Hp感染可能通过上调ASH2L的表达量而在胃癌的发生、发展中发挥着重要的作用。同时，ASH2L作为一种具有甲基转移酶活力的重要蛋白，是否在P65甲基化中发挥作用以及在幽门螺旋杆菌感染所诱导的NF-κB信号转导通路中是否发挥着相似的功能值得进一步研究。