LncRNA-MAFG-AS1在结直肠癌中的表达及临床意义

郝英豪，林 林

(河北医科大学第二医院普外三科，河北 石家庄 050000)

据我国最新肿瘤流行病数据显示，我国结直肠癌发病率和病死率已位居恶性肿瘤前列，发病率呈逐年上升趋势[1]。结直肠癌发病隐匿，早期无明显临床症状，大部分患者确诊时已处于中晚期，失去了根治的机会，目前临床上已有多种治疗手段，包括手术、放化疗及靶向治疗等，但患者预后并没有得到明显改善，5年生存率较低[2]。早期结直肠癌患者的5年相对生存率达90%，但晚期仅约10%[3]。因此，深入研究结直肠癌的发病机制以期为开发针对性治疗策略是当前必要而紧迫的医学问题，但结直肠癌发病过程涉及多种机制和过程，从分子生物学水平探讨结直肠癌的发病机制及标志物已成为精准治疗的前沿方向。近年研究表明，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在恶性肿瘤的发病过程中发挥关键作用，主要通过调控表观遗传、转录水平及转录后水平影响靶基因的表达参与肿瘤的发生发展[4-5]。在肿瘤诊治方面具有重要的科学研究和临床价值。Mo等[6]首先发现MAFG-AS1 与胃癌发生发展密切相关。后续又有研究发现在骨肉瘤细胞中MAFG-AS1 高表达，下调MAFG-AS1 可抑制骨肉瘤细胞生长[7]。但LncRNA MAFG-AS1 在结直肠癌的作用仍未阐明。研究其在结直肠癌发生发展中的作用及临床意义将为诊治结直肠癌提供新的突破。本研究拟检测LncRNA MAFG-AS1 在结直肠癌组织中表达情况，并分析其与临床病理特征的联系及探讨在预后评估当中的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年1月—2015 年1月在我院行手术切除的结直肠癌组织及癌旁正常组织各80例，其中，男性42 例，女性38例，年龄35～75岁，平均(54.68±5.87)岁，其中结肠癌39例，直肠癌41例；Ⅰ期患者10例，Ⅱ期患者21例，Ⅲ期患者25例，Ⅳ期患者24例。纳入标准：①术中切除组织病理证实为结直肠癌，术前未行放化疗和靶向治疗；②完整的临床资料及随访资料；③签署知情同意书。排除标准：①非原发性结直肠癌；②合并其他肿瘤。患者术后均随访，随访截止时间为2019年12月31日。

本研究经医院科研伦理委员会审查通过。

1.2主要试剂及仪器 从宝日(中国)生物技术有限公司购入TRIzol 提取试剂、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA 反转录试剂盒，由上海生工生物公司设计合成引物序列，使用购自Life公司的ABI7500定量PCR仪和购自美国Thermo公司的NanoDrop 2000超微量分光光度计。

1.3qRT-PCR 检测LncRNA-MAFG-AS1的表达 用TRIzol提取试剂提取结直肠癌组织和癌旁组织中的总RNA，并检测总RNA浓度和纯度，当a260/280的数值在1.8～2.1即为纯度较高，置于-80 ℃存贮待用。通过反转录试剂盒将RNA进行逆转录合成cDNA，以cDNA为模板行PCR 扩增，选用GAPDH为内参，引物序列见表1，反应体系见表2。反应程序为：95 ℃预变性5 min，1个循环；95 ℃变性30 s、60 ℃退火延伸1 min，40个循环；72 ℃延伸1 min，1个循环。采用2- △△Ct分析LncRNA-MAFG-AS1 mRNA相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

表2 反应体系Table 2 Reaction system

1.4统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析。计量资料比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。应用Kaplan-Meier(K-M)法分析生存曲线，通过Cox 回归模型分析结直肠癌患者预后的独立影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1LncRNA-MAFG-AS1在结直肠癌和癌旁正常组织的表达情况 结直肠癌组织中LncRNA-MAFG-AS1相对表达量明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(2.398±0.214vs.1.032±0.132，t=9.032，P<0.05)。

2.2LncRNA-MAFG-AS1与结直肠癌不同临床病理特征相关性分析 LncRNA-MAFG-AS1的过表达在患者不同TNM分期组及有无淋巴结转移组和有无远期转移组组间差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 LncRNA-MAFG-AS1在结直肠癌不同临床病理特征组间差异的比较Table 3 Comparison of differences in LncRNA-MAFG-AS1 in CRC patients with different clinicopathological features

2.3LncRNA-MAFG-AS1与结直肠癌患者预后的关系 随访60个月，中位随访时间39个月，以LncRNA-MAFG-AS1表达量的中位值将患者分为低表达组(n=29)和高表达组(n=51)，K-M生存分析显示高表达患者无进展生存时间(progression-free survival，PFS)为(20.36±3.21)个月，低表达患者为(29.71±4.23)个月；高表达患者的总生存时间(overall survival，OS)为(38.69±6.24)个月，低高表达患者为(54.26±5.14)个月；两组患者的PFS和OS差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 LncRNA-MAFG-AS1低表达与高表达患者的PFS与OS生存曲线A.LncRNA-MAFG-AS1低表达与高表达患者的PFS生存曲线；B.LncRNA-MAFG-AS1低表达与高表达患者的PFS与OS生存曲线Figure 1 Survival curves of PFS and OS of patients with low and high expression of LncRNA-MAFG-AS1

2.4结直肠癌患者预后的影响因素分析 单因素Cox回归分析结果显示患者的 PFS 和 OS与年龄、性别，肿瘤大小，肿瘤位置无关(P>0.05)，而与TNM分期更高、中高分化及存在淋巴结转移、远期转移以及CEA水平>10 ng/L及LncRNA-MAFG-AS1高表达有关(P<0.05)。将具有显著性的单影响因素进行Cox多因素回归分析，结果显示，TNM分期更高、中高分化及存在淋巴结转移、远期转移以及LncRNA-MAFG-AS1 高表达是影响结直肠癌预后的独立危险因素。见表4，5。

表4 结直肠癌患者预后影响因素的Cox单因素分析Table 4 Univariate Cox analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

表5 结直肠癌患者预后影响因素的Cox多因素分析Table 5 Multivariate Cox analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

3 讨 论

结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤之一，近年来，结直肠癌的发病率逐年增加，给患者和社会带来沉重负担，尽管近年随着液体活检和靶向治疗技术的应用，结直肠癌诊治水平取得较大突破，但其确诊晚、进展快，5年生存率仍然较低[8-9]。在我国，结直肠癌已经成为了威胁居民生命健康的主要癌症之一，虽然结直肠癌的病因尚不明确，但通过大量的研究已经发现与结直肠癌家族史、炎症性肠病、红肉和加工肉类摄入、糖尿病、肥胖、吸烟、大量饮酒等因素有关的，因此，保持良好的生活方式可以降低结直肠癌的发病风险[10]；同时结直肠癌发生、转移及复发过程涉及多种基因异常表达，故深入探讨结直肠癌发病过程中异常表达的基因对于探索有效的诊断和治疗方法具有更加重要的临床意义[11]。

自2002年Okazaki首次发现LncRNA以来，近二十年来不断发现新的与肿瘤发生、发展密切相关的LncRNA，通过调控肿瘤细胞的增殖、迁移及凋亡等过程，进而影响肿瘤患者的疗效和预后生存。近年来，研究LncRNA已成为精准医学关注的重点方向，但目前对LncRNA的生物学机制研究只是微乎其微，还需要国内外学者共同深入研究。先前文献报道已经证实了LncRNA在结直肠癌的发病过程中有重要作用[12]。LncRNA-MAFG-AS1定位于17q25，属于新发现的一类LncRNA，有研究指出其在肺腺癌和乳腺癌中表达异常[13-15]，但尚未在结直肠癌研究中报道。

本研究通过实时荧光定量PCR法检测LncRNA-MAFG-AS1在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达，探讨其临床意义，结果显示：结直肠癌组织LncRNA-MAFG-AS1表达明显高于癌旁正常组织；通过对LncRNA-MAFG-AS1与结直肠癌不同临床病理特征相关性的分析，结果显示，LncRNA-MAFG-AS1的过表达与患者TNM分期更高、中高分化及存在淋巴结转移和远期转移有关(P<0.05)；通过对LncRNA-MAFG-AS1与结直肠癌患者预后关系的分析，K-M生存分析结果显示：高表达患者的PFS为(20.36±3.21)个月，低表达患者为(29.71±4.23)个月；高表达患者的OS为(38.69±6.24)个月，低高表达患者为(54.26±5.14)个月；两组患者的PFS和OS差异有统计学意义(P<0.05)；Cox多因素回归分析结果显示：TNM分期更高、中高分化及存在淋巴结转移、远期转移以及LncRNA-MAFG-AS1 高表达是影响结直肠癌预后的独立危险因素。通过分析实验结果，发现LncRNA-MAFG-AS1表达异常可能参与了结直肠癌发生过程，而且其表达与TNM分期更高、中高分化及存在淋巴结转移和远期转移有关，与其他特征无关，提示LncRNA-MAFG-AS1参与了结直肠癌的发展和转移；K-M生存分析显示高表达LncRNA-MAFG-AS1患者的总生存时间及无进展生存时间均较低表达者明显减少，表明LncRNA-MAFG-AS1与结直肠癌患者预后密切相关；接下来的Cox多因素回归模型分析提示LncRNA-MAFG-AS1是结直肠癌患者的预后不良的影响因素，更加表明LncRNA-MAFG-AS1与结直肠癌预后密不可分；但其具体的分子机制仍需进一步的深入研究。

LncRNA-MAFG-AS1在结直肠癌组织中呈高表达，且与结直肠癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴结和远期转移有关，是结直肠癌患者预后独立影响因素。但其具体作用机制需进行更深入地细胞学研究。同时，本研究患者只选自了河北医科大学第二医院，可能存在选择性偏倚；且本研究中患者的时间区间较宽，随访时间较长，可能会对结果产生一定的影响；以上的结论还需要大样本、多中心进一步研究证实，为临床医生提供更真实准确的治疗信息。

综上所述，LncRNA-MAFG-AS1在结直肠癌组织中呈高表达，且与结直肠癌患者分化程度、TNM分期、淋巴结和远期转移有关，是影响结直肠癌患者预后的独立风险因素。