中药干预骨髓间充质干细胞治疗骨质疏松症的研究进展

李灵达,熊 勇,周广文,杨傲飞,吕浩源

(1. 湖北中医药大学,湖北 武汉 430060;2. 湖北中医药大学附属湖北省中医院,湖北 武汉 430060;3. 湖北中医药大学黄家湖医院,湖北 武汉 430065)

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量快速降低和骨小梁微观结构变稀疏,以及因此导致骨强度降低和骨折风险增加为特征的,与机体代谢、内分泌紊乱高度相关的全身性骨骼疾病[1-2]。在我国有着数量庞大的OP患者群体,40岁以上人口中女性患病率高达20.6%,男性发病率也有5.0%[3]。患者因骨质流失,骨强度降低导致的骨质疏松性骨折和长期慢性全身骨痛等极大地降低了患者生活质量,提高了远期死亡风险[4-5]。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是分化于中胚层的具有强大的多向分化、自我更新潜能的多能干细胞,在一定生化环境下可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞等,其低免疫原性和相对易于获取的特点使其成为目前各类组织修复的最理想种子细胞,在防治骨质疏松方面,骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的研究最为深入,成效也最为显著。但单纯的BMSCs移植疗法仍面临三大难题:体内存活率低、自发归巢数量有限、成骨分化效率不理想。中医药的现代化为解决以上难题提供了新策略。本文将从促进成骨分化、抑制成脂分化、促进迁移归巢、抑制破骨细胞活化、干预外泌体、结合生物复合材料等方面对中药干预BMSCs治疗OP的研究进展进行综述。

1 中医学对BMSCs移植防治OP的认识

1.1中医对OP的认识 中医古籍未见“骨质疏松症”这一病名,现在一般将OP归于“骨极”“肾虚腰痛”“痹证”“骨枯”“骨痿”“骨缩”“骨痹”“痿症”等中医病症范畴。如《千金要方·骨极》提到如果“肾病”则会出现“牙齿苦痛”“不能久立”“身癖脑髓酸”等症状,并称之为“骨极”。《备急千金要方·肾脏脉论第一》中指出:“足少阴气绝”则会出现“腰脊痛不可以俯仰屈伸”等症状,并将此症命名为“骨枯”。《扁鹊心书》云:“骨缩病此由肾气虚惫,肾主骨,肾水既涸则诸骨皆枯,渐至短缩。”以上所述的身长缩短、牙齿及全身骨骼疼痛、脊柱畸形和屈伸不利、腰痛、关节疼痛等症状均与OP相吻合。OP的核心病机是肾虚,其标在骨而其本在肾。如《素问·阴阳应象大论》曰“肾主身之骨髓”,《医经精义·五脏所主》中有:“肾藏精,精生髓,髓生骨,故骨者肾之所合也;髓者,精之所生也,精足则髓足,髓在骨内,髓足者则骨强。”高度概括了肾-骨-髓之间的相互关系,即肾中精气盛衰决定着髓与骨的功能强弱。如果肾气亏虚,精髓不能充养于骨则会出现《素问·痿论》中描述的“骨枯髓减”, 最终导致“骨痿”。根据中医脏腑辨证理论一般将OP分为肾阴阳俱虚证、肾阳亏虚证、肾虚血瘀证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、脾胃虚弱证以及气滞血瘀证7个常见证型[6],可见,OP的病位在肾肝脾三脏,以肾虚为核心病机,常伴有肝失条达和脾失健运,具有本虚标实的特点,本虚主要责之于肾,标实主要责之于瘀血阻滞。

1.2中医学对BMSCs的认识 现代中医学者一般把BMSCs归于“肾精”的抽象概念范畴,认为BMSCs是“肾精”在细胞层面的具象表现。二者来源相似,《灵枢·经脉》云:“人始生,先成精……皮肤坚而毛发长。”“肾精”源于父母生殖之精的阴阳和合,BMSCs源于胚胎早期的中胚层,同为机体的生命根源。两者都调控着机体的生长壮老,如《素问·上古天真论》中代表肾精充盈功能活跃的“天癸”随着年龄增长逐渐“天癸竭”,出现头发脱落,牙齿枯槁,面容憔悴甚至“无子”等一系列“形坏”的表现。相似的,BMSCs的增殖活性、多向分化能力也会随着年龄的增长而逐渐减退,导致机体衰老[7]。具体到骨生理方面,二者在骨骼发生、发育、生长以及修复和重建过程中都承担着重要角色。中医学认为“肾藏精,主骨”,肾阴阳协调,肾精充足,则骨骼壮实。BMSCs最早发现于骨髓中,其成骨活性也最强,对维持骨的正常生理功能意义重大。

1.3OP与BMSCs的关系 BMSCs在多种转录因子、信号通路、mRNA等的调控下从成骨祖细胞到成骨前体细胞,逐步分化为成骨细胞,最后矿化为骨细胞,这一分化过程是骨骼形成、发育、修复、重建的核心环节[8]。OP的发生和BMSCs的功能降低者互为因果。随着机体老化,BMSCs的活性降低,干性逐渐丧失,凋亡增加,成骨分化减弱,成脂分化增强,归巢效率大幅降低,这些都是导致骨质疏松的重要因素[9-10]。反过来,OP患者以及易患OP的人群(如老年人、绝经后女性、长期大量使用糖皮质激素者)的骨髓微环境会引起BMSCs活性降低、成脂分化大于成骨分化、归巢率低下的病理表现[1]。OP的防治方面,大量实验研究证明BMSCs移植以及促进BMSCs增殖、成骨、归巢等手段均能高效阻断这一病理性因果循环[10-12]。

2 中药通过多途径干预BMSCs治疗OP的实验研究现状

2.1中药对BMSCs增殖以及成骨分化的影响 BMSCs的成骨分化和促进成骨细胞成熟的能力调控着骨组织的生理病理全过程。中药可调控成骨相关的信号通路及其启动因子和效应原件。通路方面,以Wnt、BMP通路的研究最广泛且深入。转录因子方面,RUNX家族转录因子2 (Runx-2)和Osterix等效应转录因子决定着成骨分化走向。

2.1.1中药单味药、中药单体对BMSCs增殖以及成骨分化的影响 淫羊藿苷(icariin,ICA)可与雌激素受体结合发挥弱雌激素效应,高巳东等[13]通过疗效对比发现相较于单独使用ICA或雌激素(estrogen,E2),ICA与E2协同使用对大鼠BMSCs成骨分化的促进作用更明显。此外,ICA对内环境E2水平的双向调节作用和上调核内雌激素受体α(estrogen receptor-α,ERα)表达的作用,可消除激素替代疗法的不良反应。实验表明淫羊藿素能通过激活BMP-2/RUNX2/OSX信号通路诱导BMSCs向成骨细胞分化,起到抗骨质疏松的作用[14]。值得注意的是淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ的代谢产物中都包含淫羊藿素,因而淫羊藿在体内的抗骨质疏松活性强大且持久。Wnt/β-catenin通路是BMSCs向成骨细胞方向分化成熟的关键路径。在经典路径中的GSK3β(glycogen synthase kinase 3 beta)可对β-catenin进行降解从而抑制下游成骨相关基因的表达,而LRP5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6)与Wnt蛋白结合可活化GSK-3β结合蛋白(GBP)从而抑制GSK3β,保证足量的β-catenin进入细胞核,使RUNX2与Osterix的mRNA表达增加,改善成骨分化率。相关研究发现骨碎补含药血清对BMSCs的增殖及成骨分化的促进作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关[15]。薛海鹏等[16]直接给予大鼠不同浓度骨碎补水煎液灌胃,成骨相关指标检测结果证实骨碎补饮片以水煎服的方式也能有效诱导BMSCs定向成骨。关于黄芪上调血清维生素D对于BMSCs成骨分化的意义,李倩等[17]的实验研究表明这一作用是黄芪通过上调维生素D活化酶CYP27B1 mRNA,下调维生素D灭活酶CYP24A1 mRNA并调节其相应蛋白的表达,从而维持稳定的血清1,25(OH)2D3(维生素D在体内代谢后发挥作用的活性成分)含量,为BMSCs成骨分化提供了所需的微环境。李应福[18]发现低剂量组(4.2 μL/100 g)麝香可显著提高大鼠BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性,增加钙化结节数量,上调Ⅰ型胶原表达量,证明了麝香具有良好的促BMSCs定向成骨作用。杨锋等[19]发现补骨脂素可提高BMSCs的ALP活性,利用生物芯片和生物信息学工具对这一过程中lncRNA的表达差异变化进行筛选和分析,得出差异最显著的两个lncRNA(XR009483、XR007366),用PCR技术进行检测并比对。提示补骨脂素促进BMSCs成骨分化作用的机制与XR009483、XR007366的表达差异高度相关。

2.1.2中药复方对BMSCs增殖以及成骨分化的影响 朱余俊等[20]收集OP患者手术中取出的骨髓分离BMSCs并培养传代。制备复方补肾活血颗粒含药血清后,以不同浓度对人BMSCs进行干预,结果发现5%剂量组对人BMSCs的增殖和促成骨分化作用最突出,Wnt/PI3K-AKT信号通路中的PI3K、AKT、P-AKT、LRP5、β-catenin mRNA和蛋白的高表达可能是其刺激人BMSCs增殖和成骨的内在机制。高举会等[21-22]发现相较于福善美组和诱导剂组,左归丸、右归丸对大鼠BMSCs的促成骨分化作用都更显著,且二者的机制都涉及Hedgehog信号通路的激活,都可以上调BMSCs中SHH、GLI1的mRNA表达量,除此之外左归丸还能增加BMP2、SMO、GPR48的表达。周湘琳等[23]将补肾健骨方制备为不同浓度的含药血清(5%、10%、15%、20%、25%)加入细胞培养基中,分别对大鼠BMSCs和ROBs进行体外培养,结果发现20%含药血清提升ROBs的各项增殖和成骨指标最明显,10%含药血清对大鼠BMSCs的增殖和成骨活性促进作用最显著。

2.2中药对BMSCs成脂分化的影响 OP患者髓腔内脂肪含量显著高于正常人,这与BMSCs的成脂分化活性增强而成骨能力降低高度相关。一般而言,能够促使BMSCs向成脂细胞分化的因素,反过来会抑制向成骨分化,而诱导成骨分化的因子也能够抑制脂肪细胞的分化成熟[24],故具有抑制成脂分化功能的药物也具备促进成骨的作用,进而实现对BMSCs成骨-成脂分化的双向调节。

2.2.1中药单味药、单体对BMSCs成脂分化的影响 相关研究发现各剂量骨碎补总黄酮组的β-catenin mRNA、RUNX2 mRNA的表达量均较空白组显著升高,而过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) mRNA的表达量较空白组没有明显变化,提示骨碎补总黄酮可通过Wnt/β-catenin通路上调成骨相关因子的表达,同时使成脂分化转录因子的表达保持原有水平,进而将BMSCs的骨-脂分化维持在正常水平[25]。而王军松等[26]的实验则证明了骨碎补总黄酮可介导Wnt/β-catenin信号通路对PPARγ mRNA及蛋白的表达起到强大的抑制作用。李琰等[27]发现骨碎补水煎液不仅能通过上调Wnt/β-catenin信号通路中Wnt10b、β-catenin、LRP5 mRNA的表达使去卵巢大鼠骨密度升高,还能下调PPARγ、LPL mRNA的表达,降低各项成脂指标。张洪跃等[28]的研究发现补骨脂素对BMSCs的分化倾向也具有双向调节作用,其中抑制成脂倾向的作用是通过下调C/EBPβ、PPARγ的蛋白表达实现的。刘颖等[29]发现用朝藿定A干预小鼠原代BMSCs可激活骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)/核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)/核因子-κB受体活化因子(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB,RANK)信号通路从而上调OPG/RANKL的比值,进而发挥促BMSCs成骨分化、促成骨细胞矿化的作用,同时其高剂量组表现出较强的抑制脂向分化能力,通过以上机制朝藿定A可减少骨量流失治疗骨质疏松。有研究指出淫羊藿苷的抗骨质疏松作用是通过调控Wnt/β-catenin信号通路双向调节BMSCs的定向分化实现的。一方面上调ALP、RUNX2、骨桥蛋白(OPN)等成骨标志物的表达促BMSCs成骨,同时下调PPARγ、Adipsin、FABP4等成脂关键因子表达以抑制BMSCs脂向分化[30]。

2.2.2中药复方对BMSCs成脂分化的影响 刘波等[31]发现体外培养的大鼠BMSCs中的成脂分化关键标记物PPARγ与C/EBPα能在二仙汤含药血清的干预下显著降低,BMP-2的表达则被上调,另外二仙汤能上调OPG的表达,竞争性地减少RANKL与RANK的配对,阻断骨吸收信号的传递,即二仙汤既能够双向调节BMSCs的分化倾向,又能双相干预成骨-破骨进程,从而维持骨动态平衡。陈锦成等[32]发现PD98059(MAPK信号通路抑制剂)可抑制龟鹿二仙胶含药血清对大鼠BMSCs的促增殖作用,抑制龟鹿二仙胶含药血清对Ets1、ERK1/2、CollagenⅠ、RUNX2等成骨相关mRNA和蛋白表达水平的提高,相较于龟鹿二仙胶组,PD98059降低了细胞的ALP活性和矿化程度,高表达成脂转录因子PPARγ。可见,龟鹿二仙胶调控大鼠BMSCs骨-脂分化平衡的机制与ERK1/2/ Ets1信号通路紧密相关。陈沙等[33]的研究发现壮骨止痛胶囊可使BMSCs的Beclin1和LC3表达降低,使p62表达升高,PPAR-γ表达降低,ALP活力增强,从而改善骨密度。谭登等[34]报道补肾通络方可抑制chemerin的表达,降低chemerin介导的炎症反应程度,又因为chemerin和PPARγ在基因层面有着共同的效应因子,两者在BMSCs的成脂分化中显示出正相关,可见补肾通络方对BMSCs骨-脂分化平衡的调节是通过调控chemerin的表达来实现的。

可见,中药在调节BMSCs成脂分化方面与Wnt/β-catenin和OPG/RANKL/ RANK通路的关系最为密切,而PPARγ和C/EBPβ是最终决定BMSCs向脂肪细胞分化的关键转录因子。

2.3中药对BMSCs迁移、归巢的影响 BMSCs的归巢(homing)分为动员(motility )、迁移(migration)两个连贯的步骤,即BMSCs从骨髓进入血液系统及其循趋化因子浓度梯度靶向聚集到待修复组织的过程。研究表明骨质疏松模型大鼠和OP患者的BMSCs归巢能力明显不足[35-36]。归巢作用是连接BMSCs增殖分化与骨组织修复的关键环节,归巢效率的高低直接决定着BMSCs防治OP的效果优劣。与BMSCs归巢相关的信号转导路径仍有待验证,其中基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)/CXC趋化因子受体4(CXC motif chemokine receptor 4,CXCR4)信号通路是目前学界认可度最高的明星通路,此外,PI3K/AKT、MCP-1/CCR2、MAPK/ERK、PKC等通路也被认为是影响BMSCs迁移的重要通路[18,37-40]。中药对BMSCs归巢的促进作用很好地从分子生物学角度印证了中医“补肾、引经”理论的科学性[18,41]。

中医理论认为气机阻滞、血行不畅也是“骨痿”的致病因素,而气血不利往往表现为BMSCs周围微环境的氧分压低于正常。宁宇[37]发现柚皮苷提高低氧环境下BMSCs迁移效率的机制与其能够激活SDF-1α/CXCR4通路强相关。临床上麝香经常作为引经药治疗各种肾虚骨病,现代研究表明其“引药直达病所”的功效与其激活MAPK/ERK1/2、PI3K/AKT及PKC信号通路从而促进BMSCs向骨组织迁移归巢紧密相关[18]。杨傲飞[41]运用高通量测序技术对兔成骨细胞外泌体进行测序并分析,得出miR-122-5p是成骨细胞源性外泌体调控BMSCs分化迁移的重要靶点,而淫羊藿苷可以通过干预这一靶点从而达到促兔BMSCs成骨分化和迁移的目的。孙石磊[42]发现骨碎补含药血清结合转染HO-1和3D支架对大鼠BMSCs干预后可显著下调金属基质蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)的表达(P<0.05),上调金属基质蛋白酶1(MMP-1)的表达(P<0.05),从而增强BMSCs的迁移能力。余翔等[43]给予骨质疏松大鼠尾静脉移植同种异体BMSCs(Brd U示踪标记)并给予龟板水提液灌胃,发现骨质疏松大鼠椎体内Brd U阳性表达显著高于单纯BMSCs移植组(P<0.05);划痕实验中龟板组的划痕区域在12 h、24 h后BMSCs数量较空白组显著增多(P均<0.05);龟板+BMSCs组大鼠在骨微观结构、骨强度以及组织形态学方面的改善也最为显著(P<0.01)。可见龟板可通过提高BMSCs的归巢量从而提升BMSCs的骨修复效率防治骨质疏松。

2.4中药通过干预BMSCs对破骨细胞的影响 中药不仅可以直接作用于破骨细胞,阻碍其激活和分化成熟,还可以通过干预BMSCs,间接抑制破骨细胞的骨破坏效应。蒯凤等[44]取冬凌草素干预过的BMSCs培养基上清液加入骨髓单核细胞培养基,结果发现凌草素可以干预BMSCs及其分化的成骨细胞,通过Wnt/β-catenin信号通路下调其RANKL的表达,上调OPG的表达,进而使骨髓单核细胞向破骨细胞的分化活性受到抑制。张峻玮等[45]研究发现骨碎补可激活Wnt/β-catenin信号通路,使培养于Transwell上室的BMSCs的OPG高表达,RANKL低表达,OPG/RANKL比值下降可使RANKL/RANK信号通路受到抑制,进而降低Transwell下室的骨髓单核细胞向破骨细胞率。可见,中药干预BMSCs抑制破骨细胞的分化成熟的机制与Wnt/β-catenin通路和OPG/RANKL/RANK通路的信号传递相关。

2.5中药通过外泌体干预BMSCs对骨修复的影响近年来,随着对MSCs研究的深入,其局限性(增加致瘤率、排斥反应、伦理困境、体内存活率低等)也日益引起关注。研究表明BMSCs逆转骨质疏松的作用主要是由其旁分泌的外泌体(exosomes,EXO)所介导的,对于调控成骨-成脂平衡、成骨-破骨平衡、骨组织周围血管新生起着至关重要的作用。

EXO的磷脂双分子层使其具有极强的体内外稳定性,是中药活性成分的理想载体。王一凡等[46]采用超声技术将淫羊藿苷装载于BMSCs源性EXO内,观察ICA-EVs复合物对BMSCs成骨分化的影响,结果相较于ICA组,2周后ICA-EVs复合物组的ALP活性更强,β-catenin、RUNX2表达显著增高(P<0.01)。郭招娣[47]的实验发现异补骨脂素与BMSCs共培养后提取的EXO能激活circ8604/miR-26b-3p/ERα轴从而促进成骨前体细胞的分化成熟。杨傲飞[41]分离培养成骨细胞并用淫羊藿苷干预,提取干预后的EXO与BMSCs共培养,结果发现淫羊藿苷可以调控miRNA-122-5p在成骨细胞EXO内的表达,其表达量与EXO提升BMSCs成骨和迁移活性的作用呈正相关。王礼宁[48]研究发现脂肪细胞来源的EXO可通过其携带的miRNA-122-5p调控SPRY2介导的MAPK信号通路,进而影响骨髓内BMSC的成骨与成脂分化,改善骨脂平衡,而温肾通络止痛方可促进脂肪细胞分泌EXO,并通过上述机制发挥抗骨质疏松效应。

2.6中药与生物复合材料协同干预BMSCs治疗OP的相关研究 生物复合材料与中药活性成分相结合应用于骨组织的修复是当前组织工程学的一个前景广阔的研究方向。大量研究表明生物复合材料的生物兼容性和组织亲和性可以显著提高中药促BMSCs向成骨细胞分化效率,促进新骨生成,还能作为观察平台对BMSCs增殖分化情况进行评估。吴涛等[49]的实验表明CS/HA复合材料良好的骨诱导、骨传导性能结合淫羊藿苷的促rBMSCs成骨分化活性,进而更高效地促进骨微结构修复。李东晓等[50]将大鼠BMSCs注入PLA-GOL支架并置于扩散盒内,植入大鼠背部肌肉,然后给予淫羊藿总黄酮(total flavonoids of herba epimedii,HETF),结果显示各组PLA-GOL支架内BMSCs均可见大量成骨细胞。这一组织工程学方法更好地模拟了中药对体内微环境中的BMSCs增殖和成骨分化的干预效果,为观察中药干预BMSCs分化治疗OP提供了更直观、更还原、更便捷的研究方法。牡荆素与纳米支架材料PPCN-G结合使用可高效促进MSCs的体外成骨分化。体内注射的PPCN-G在第4周可完全降解,牡荆素与PPCN-G、BMP9结合可显著改善骨组织微观结构[51]。研究表明骨碎补含药血清结合3D干细胞组织工程技术干预大鼠BMSCs,可使BMSCs增殖活跃,凋亡减少,迁移能力增强,成骨转录因子高表达,从而发挥对骨组织的修复作用[42]。

3 小结与展望

综合前述理论和实验可知,针对“肾阴阳虚损,肾气、肾精不足”的纠正贯穿于中药干预BMSCs防治OP的始终,与《内经》中“骨痿者,补肾法治之”之说契合,在用药分类上以单味补肾药、补肾药单体活性成分、补肾复方的研究最庞杂且深入,涵盖BMSCs增殖、分化、归巢的每一个节点。另外活血化瘀、补气理气类中药在改善BMSCs所在的微环境,提高BMSCs生存能力方面也有着举足轻重的地位。总体来说,中药干预后的BMSCs在体内外均表现出增殖旺盛、存活率提升、成骨分化活跃、归巢迁移活性增强等特征,可谓疗效卓著。但不可避免的,中药干预BMSCs治疗OP的研究仍存在诸多瑕疵:①中药复方是中医辨证论治,整体施治理论的重要践行方式,但中药复方干预BMSCs防治OP的研究相对偏少。②骨质疏松动物的造模忽视中医证型的模拟还原。③动物体内实验以静脉移植中药干预后的BMSCs为主,注射计量尚无公认的统一量化标准。④目前此类研究在机制方面往往局限于探究某单一通路,缺乏网状多通路交叉印证,特别是BMSCs在骨修复这一连续性过程中成骨相关通路与归巢通路之间的衔接对话鲜有研究。笔者认为今后应重视基于BMSCs成骨-归巢相关通路的交叉对话,深入挖掘中医经典补肾强骨类复方治疗OP的潜力并探明其机制。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。